Integration of plastids in the plant calcium signalling network in response to environmental stimuli.

Transient elevations in intracellular free Ca2+ concentration are known to mediate plant responses to a wide variety of abiotic and biotic stimuli. To elucidate the contribution of plastids to Ca2+ homeostasis and signalling in the plant cell, we generated Arabidopsis thaliana lines stably expressing the bioluminescent Ca2+ reporter aequorin targeted to different chloroplast subcompartments, i.e. the outer envelope, the stroma, the thylakoid membrane and the thylakoid lumen. Ca2+ measurements in response to environmental stimuli were carried out in entire seedlings, as well as in cell suspension cultures, obtained from in vitro dedifferentiation of Arabidopsis explants. Monitoring of Ca2+ dynamics allowed to dissect stimulus-specific Ca2+ signals in amyloplasts and chloroplasts, as well as the occurrence of dark-induced intraplastidial Ca2+ fluxes, characterized by unique kinetic parameters. To get insights into the homeostatic mechanisms allowing for chloroplast Ca2+ fluxes, a mutant line lacking a putative plastidial Ca2+-permeable transporter was transformed with the construct encoding the stroma-targeted aequorin chimera. The obtained results shed new light on the complex network underlying the Ca2+-mediated transduction of environmental stimuli in plants at an intracellular level. This complex kit of chloroplast-targeted aequorin probes turned out to be a valuable tool for the monitoring of organellar Ca2+ dynamics during signal transduction. In the last part of the work the ability of Chlamydomonas reinhardtii, a unicellular freshwater/soil green alga, to evoke intracellular Ca2+ changes ([Ca2+]) in response to different environmental stimuli was considered. As there is no evidence in the literature about environmental stimuli that trigger cytosolic [Ca2+] variations in Chlamydomonas, the first step had necessarily to deal with the identification of environmental cues evoking cytosolic [Ca2+] elevations in the microalga. Chlamydomonas cells, loaded with the Ca2+-responsive fluorescent dye Oregon Green-BAPTA, were challenged with stimuli previously used in this work on Arabidopsis. Moreover, the alga was also challenged with a hypoosmotic shock, that resulted to trigger cytosolic [Ca2+] elevations, and the nature of the observed dynamics was investigated. Taken together, the obtained results indicate that some aspects of Ca2+ signalling do not appear to be conserved between the green alga Chlamydomonas and the higher plant Arabidopsis, but other elements in Ca2+-mediated responses to osmotic shocks are similar. These differences may be due to the different Ca2+ signalling toolkits found in plants and algae and/or to the different physiology of these model organisms, both belonging to the Viridiplantae clade. Investigation on the Ca2+ handling mechanisms operating in different photosynthetic organisms of phylogenetic interest may shed new light on the evolutionary history of the Ca2+ signalling toolkit.

È noto che innalzamenti transitori nella concentrazione intracellulare di Ca2+ mediano le risposte delle piante a una vasta gamma di stimoli biotici e abiotici. Per chiarire il contributo dei plastidi all’omeostasi del Ca2+ e alle vie di segnalazione mediate dal Ca2+ nella cellula vegetale, sono state generate linee di Arabidopsis thaliana che esprimono stabilmente l’indicatore bioluminescente di Ca2+ equorina indirizzato a diversi subcompartimenti del cloroplasto: la membrana esterna dell’involucro, lo stroma, la membrana tilacoidale e il lume tilacoidale. Misurazioni di Ca2+ in risposta a diversi stimoli ambientali sono state effettuate in plantule e in colture cellulari in sospensione, ottenute da dedifferenziazione in vitro di espianti di Arabidopsis. Il monitoraggio delle dinamiche di Ca2+ ha permesso di evidenziare segnali Ca2+ stimolo-specifici in amiloplasti e cloroplasti, e la presenza di flussi di Ca2+ intraplastidiali indotti dalla transizione luce-buio, caratterizzati da peculiari parametri cinetici. Per ottenere informazioni sui meccanismi di omeostasi che consentono i flussi di Ca2+ nel cloroplasto, una linea mutante difettiva in un putativo trasportatore plastidiale permeabile al Ca2+ è stata trasformata con il costrutto codificante l’equorina chimerica indirizzata allo stroma. I risultati ottenuti hanno fornito nuove evidenze sulla complessa rete di trasduzione intracellulare di stimoli ambientali mediata dal Ca2+ nelle piante. Il complesso kit di sonde basate sull’equorina indirizzata ai cloroplasti si è rivelata un valido strumento per il monitoraggio delle dinamiche di Ca2+ nell’organello durante la trasduzione di segnali ambientali. Nell'ultima parte del lavoro è stata considerata la capacità di Chlamydomonas reinhardtii, un’alga verde unicellulare d'acqua dolce, di rispondere a differenti stimoli ambientali con variazioni della concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]). Poiché in letteratura non vi sono evidenze a proposito di segnali che inneschino variazioni della[Ca2+] citosolica in Chlamydomonas, il primo passo è stato quello di identificare stimoli ambientali che inducessero innalzamenti della [Ca2+] citosolica nella microalga. Cellule di Chlamydomonas, caricate con il colorante fluorescente sensibile al Ca2+ Oregon Green-BAPTA, sono state trattate con stimoli precedentemente utilizzati in questo lavoro su Arabidopsis. Inoltre, l'alga è stata anche stimolata con uno shock ipoosmotico, che è risultato indurre innalzamenti della [Ca2+] citosolica. La natura di queste dinamiche osservate è stata indagata in maniera approfondita. Nel loro insieme, i risultati ottenuti indicano che alcuni aspetti della segnalazione mediata dal Ca2+ non sembrano essere conservati tra l'alga verde Chlamydomonas e la pianta superiore Arabidopsis, ma altri elementi delle risposte Ca2+ agli shock osmotici sembrano essere simili. Queste differenze potrebbero essere dovute ai diversi strumenti utilizzati nelle vie di segnalazione del Ca2+ che si trovano nelle piante e nelle alghe e/o alla diversa fisiologia di questi organismi modello, entrambi appartenenti alla gruppo delle Viridiplantae. Future indagini sui meccanismi di mobilizzazione del Ca2+ che operano nei diversi organismi fotosintetici di interesse filogenetico potrebbero far luce sulla storia evolutiva delle vie di segnalazione basate sul Ca2+.