Mitochondrial axonal transport in vivo: development of a new assay in zebrafish to study the effects of Familial Alzheimer’s Disease Presenilin 2 mutations

Alzheimer'€™s disease (AD) is the most common form of neurodegenerative disease, affecting more than 35 million people worldwide. Although the majority of cases is caused by a combination of risk factors (genetic and environmental), a small percentage is genetically inherited and is called familial Alzheimer'€™s disease (FAD). FAD is caused by mutations in three genes: APP, which encodes for the amyloid precursor protein, and presenilins genes (PSEN1 and PSEN2), encoding for presenilin 1 and 2 (PS1, PS2), respectively. Mutations in these genes result in an increased formation of the product of APP cleavage, the amyloid Aβ peptide: in AD the levels of Aβ42, the most aggregation-prone, 42 amino acids long, form of Aβ, are increased, leading to the formation of amyloid plaques in patients'€™ brains. According to the "€œamyloid hypothesis"€, Aβ accumulation triggers a cascade that leads to progressive synaptic and neuronal injury and eventually to cell death. In this scenario, presenilins play a key role. Presenilins are membrane spanning proteins known to most as key components of the γ-secretase, the enzymatic complex located in plasma membrane and internal membranes (Golgi and endoplasmic reticulum, ER) responsible for the cleavage of many proteins, including NOTCH and APP. However, they also have γ-secretase-independent functions: in particular PS2, but not PS1, has been recently described to be able to modulate ER-mitochondria tethering and their Ca2+ cross-talk. The overexpression of FAD-linked PS2 mutants increases both the tethering and the Ca2+ transfer between these two organelles. It’s worth mentioning that alterations in Ca2+ signalling are emerging as an attractive hypothesis to explain AD pathogenesis: many cellular processes are dependent on a proper Ca2+ signalling, and any dysfunction is expected to have consequences on neuronal physiology. Among these processes, mitochondrial axonal transport represents a very interesting feature: mitochondria are key organelles for cells, whose functions influence several cell life aspects as well as cell death. Mitochondrial axonal transport is finely regulated by Ca2+: increases in cytosolic Ca2+ levels arrest mitochondrial movements along axons, to ensure their deliver to metabolically active sites, such as activated synapses. The previously described FAD-PS2 mediated alterations in Ca2+ handling and in the physical interaction between ER and mitochondria could potentially modify axonal mitochondrial transport, and an altered mitochondrial distribution has been reported within neuronal cells in different AD models. Zebrafish has emerged as an attractive vertebrate system to study human diseases: in particular, its genome is extensively annotated and orthologs of genes involved in FAD have been already identified. Mitochondrial axonal transport analysis is strongly facilitated by the transparency of embryos and by the availability of tools to manipulate gene expression. We here generated a method to study PS2-dependent effects on mitochondrial dynamics in vivo. Firstly, by genetically targeting the fluorescent protein Kaede to mitochondria in Rohon-Beard (RB) sensory neurons, we have characterized mitochondrial axonal transport properties during development. We found that the percentage of mobile mitochondria is reduced from one to three days post fertilization (dpf) embryos; mitochondrial average speed, however, increases during development. The directionality of transport is strongly biased towards the anterograde one, reflecting a net translocation of mitochondria from the cell body to peripheral arbors. Nocodazole, a strong inhibitor of microtubule polymerization, totally disrupts mitochondrial axonal transport, validating the sensitivity of our assay. Interestingly, the mitochondrial axonal transport parameters, measured with our approach, are similar to those reported in recent in vivo studies. We found that psen2 knockdown (KD), but not psen1 KD, reduces the percentage of motile organelles, compared to controls. This phenotype is recovered by rescue experiments, in which PS2 was re-introduced, demonstrating a specific PS2-dependent effect. On the other side, human PS2 expression in zebrafish leads to different results: human PS2 (both wild-type, wt, and mutated) is expressed at the level of intracellular membranes (mainly in the ER) in the soma and through the axon of RB neurons but, while overexpression of wt PS2 does not affect mitochondrial axonal transport, that of the PS2-T122R mutant increases the percentage of motile mitochondria. Moreover, we verified whether intra-mitochondrial Ca2+ rises could be involved as signal in the regulation of mitochondrial axonal transport, as previously proposed: the KD of the mitochondrial calcium uniporter (Mcu), the protein responsible for mitochondrial Ca2+ uptake, however, is without effect on either the speed and the percentage of motile mitochondria in RB neurons. Mitochondrial morphology and density were also investigated and both features resulted unchanged upon the different treatments, suggesting that the observed alterations in mitochondrial axonal transport induced by PS2 are due to neither an imbalance in mitochondrial fusion and fission nor an abnormal mitochondrial biogenesis. Further investigations are required to better understand the mechanism through which PS2 alters mitochondrial axonal transport, as well as the role played by this alteration in AD pathogenesis.

La malattia di Alzheimer (AD, Alzheimer'€™s disease) é la malattia neurodegenerativa più diffusa, colpendo più di 35 milioni di persone a livello mondiale. Nonostante la maggior parte dei casi sia dovuta ad una combinazione di fattori di rischio (genetici e ambientali), una piccola percentuale é ereditata geneticamente ed é perciò chiamata forma familiare di AD (FAD). Questa forma di Alzheimer é causata da mutazioni in tre geni: APP, che codifica per la proteina precursore dell'amiloide, e nei geni PSEN1 e PSEN2, codificanti rispettivamente per la presenilina 1 e 2 (PS1, PS2). Mutazioni in questi geni inducono un aumento nella formazione del prodotto del taglio di APP, il peptide β amiloide (Aβ): nella malattia i livelli di Aβ42, la forma di 42 amminoacidi del peptide Aβ più prona ad aggregare, sono aumentati portando alla formazione delle placche amiloidi che si ritrovano numerose nel cervello dei pazienti. Secondo "€œl'€™ipotesi amiloide"€ l'accumulo di Aβ innesca una cascata di eventi che porta ad una progressiva disfunzione a livello delle sinapsi e dei neuroni ed infine alla morte cellulare. In questo scenario, le preseniline svolgono un ruolo importante. Le preseniline sono proteine di membrana ben conosciute come componenti della γ-secretasi, un complesso enzimatico localizzato a livello della membrana plasmatica e delle membrane interne (Golgi e reticolo endoplasmatico, RE) responsabile del taglio di diverse proteine, tra cui NOTCH e APP. Tuttavia le preseniline svolgono anche funzioni indipendenti dalla γ-secretasi: in particolare é stato descritto recentemente che PS2, ma non PS1, é in grado di modulare la vicinanza tra RE e mitocondri, e lo scambio di Ca2+ tra questi due organelli. La sovra-espressione di mutazioni in PSEN2 associate a FAD aumenta sia la vicinanza fisica che il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Alterazioni nell'€™omeostasi intracellulare del Ca2+ sono comunemente riportate in diversi modelli sperimentali della patologia di Alzheimer e ciò ha fatto emergere un'€™ipotesi patogenetica aggiuntiva in cui tali fenomeni svolgono un ruolo chiave: molti processi cellulari, infatti, dipendono da un adeguato signalling intracellulare del Ca2+ e ci si aspetta che eventuali disfunzioni abbiano conseguenze sulla fisiologia del neurone. Tra i processi cellulari mediati dal Ca2+, il trasporto dei mitocondri lungo gli assoni rappresenta un punto fondamentale: i mitocondri sono organelli essenziali per la cellula, capaci di modulare, con la loro funzionalità, diversi aspetti della fisiologia della cellula. Il trasporto assonale dei mitocondri é finemente regolato dal Ca2+: aumenti nei livelli citosolici di Ca2+ interrompono il trasporto dei mitocondri lungo gli assoni, al fine di localizzarli in siti opportuni ad elevata attività  metabolica (ad es. in sinapsi attive). Le alterazioni nell'€™omeostasi intracellulare del Ca2+ così come l'€™aumentata vicinanza tra RE e mitocondri, dovuti all'€™espressione di mutazioni in PSEN2 associate a FAD, potrebbero quindi modificare il trasporto assonale dei mitocondri, e determinare alterazioni nella distribuzione dei mitocondri a livello neuronale, caratteristica riscontrata in diversi modelli di AD. Zebrafish si é dimostrato un modello animale molto attraente per studiare diverse malattie umane: in particolare, il suo genoma é ampiamente annotato e gli ortologhi dei geni coinvolti nelle forme familiari di AD sono già stati identificati. L'€™analisi del trasporto assonale dei mitocondri é facilitata dalla trasparenza degli embrioni e dalla disponibilità di strumenti che consentono di manipolare in maniera semplice l'€™espressione dei geni d'€™interesse. Nel lavoro qui presentato abbiamo generato una metodica che consente lo studio in vivo delle dinamiche assonali mitocondriali dipendenti dalla presenilina 2. Per prima cosa, attraverso l'€™espressione della proteina fluorescente Kaede indirizzata ai mitocondri dei neuroni sensitivi Rohon-Beard (RB), abbiamo caratterizzato le proprietà del trasporto assonale dei mitocondri nel corso dello sviluppo: la percentuale di mitocondri mobili si riduce passando da embrioni di un giorno a quelli di tre; tuttavia la velocità media del loro trasporto aumenta nel corso dello sviluppo. La direzionalità del trasporto assonale dei mitocondri é fortemente sbilanciata verso il trasporto anterogrado, rispecchiando una traslocazione netta di mitocondri dal corpo cellulare alle ramificazioni assonali terminali. Il trattamento con nocodazolo, un forte inibitore della polimerizzazione dei microtubuli, altera completamente il trasporto assonale dei mitocondri, validando così la sensibilità del nostro metodo di analisi. Le caratteristiche del trasporto mitocondriale misurate con il nostro approccio, inoltre, sono simili a quelle riportate in altri studi in vivo recentemente pubblicati. Successivamente, abbiamo verificato la presenza di eventuali effetti sul trasporto indotti dall'€™espressione di presenilina 2: abbiamo dimostrato come il knockdown di psen2, ma non di psen1, riduce la percentuale di mitocondri mobili. Questo fenotipo é ripristinato da esperimenti di rescue, in cui viene re-introdotto il gene per la presenilina 2, dimostrando un effetto specifico della proteina. L'€™espressione della PS2 umana in zebrafish ha portato a risultati diversi: la proteina umana (sia wild-type, wt, che mutata) si esprime nelle membrane interne a livello del corpo cellulare e lungo l'€™assone dei neuroni RB, dove si localizza principalmente a livello del RE. Mentre però la sovra-espressione della PS2 wt non ha alcun effetto sul trasporto assonale dei mitocondri, la forma mutata PS2-T122R aumenta la percentuale di mitocondri mobili. Abbiamo inoltre verificato se aumenti di Ca2+ a livello della matrice mitocondriale, indotti da un aumento del Ca2+ a livello citosolico, potessero funzionare da segnale coinvolto nella regolazione del trasporto mitocondriale, come recentemente proposto: il knockdown della proteina principale dell'€™uniporto mitocondriale del calcio (Mcu, Mitochondrial calcium uniporter), tuttavia, non ha nessun effetto sia sulla percentuale di mitocondri mobili che sulla loro velocità media. Dato che cambiamenti nella forma dei mitocondri possono influenzarne velocità e trasporto abbiamo analizzato anche la morfologia e la densità dei mitocondri lungo gli assoni dei neuroni RB dopo espressione di PS2 umana: entrambi i parametri tuttavia sono risultati invariati nelle varie condizioni analizzate, suggerendo che le alterazioni osservate nel trasporto mitocondriale indotte dalla PS2 non siano dovute né ad uno squilibrio nella fusione/fissione né ad una alterata biogenesi dei mitocondri. Ulteriori studi saranno necessari per comprendere il meccanismo che modula l'€™alterato trasporto mitocondriale qui descritto, così come il peso di queste alterazioni nella patogenesi dell'€™Alzheimer.