INVESTIGATION OF THE PATHOPHYSIOLOGY OF MIGRAINE USING FAMILIAL HEMIPLEGIC MIGRAINE MOUSE MODELS

Migraine is a common, highly disabling episodic neurological disorder affecting more than 10% of the population and arises from a primary brain dysfunction that leads to episodic activation and sensitization of the trigeminovascular pain pathway. Familial hemiplegic migraine (FHM) is a rare and very severe monogenic autosomal dominant subtype of migraine with aura. Apart from the motor aura and the possible longer duration of the aura, typical FHM attacks resemble migraine with aura attacks (Pietrobon and Moskowitz, 2013); thus, FHM can be considered as a model of the common forms of migraine. Gain-of-function missense mutations in CACNA1A gene, encoding the pore-forming subunit of the neuronal voltage-gated Ca2+ channel CaV2.1 (also known as P/Q-type Ca2+ channel), cause FHM type 1 (FHM1) and loss-of-function mutations in ATP1A2, the gene encoding the astrocytic Na,K-ATPase α2 subunit, cause FHM type 2 (FHM2) (Ophoff et al., 1996; De Fusco et al., 2003). FHM knock-in (KI) mice carrying mutations causing either FHM1 or FHM2 show facilitation of induction and propagation of experimental CSD (van den Maagdenberg et al., 2004, 2010; Leo et al., 2011), the phenomenon underlying migraine aura and a key triggering event for trigeminovascular activation. FHM1 KI mice, carrying the R192Q mutation, show an increased influx of Ca2+ through P/Q-type Ca2+ channels in neurons, including cortical pyramidal cells, and an increased probability of glutamate release at cortical pyramidal cells synapses (Pietrobon, 2010; Tottene et al., 2009), that may explain the facilitation of experimental CSD. Recent findings in our laboratory (Fabbro, Sessolo, Vecchia and Pietrobon, manuscript in preparation) show that the frequency of the up-states recorded in acute cortical slices, that resemble slow oscillation in vivo (Steriade et al., 1993), is larger in FHM1 KI than WT mice, suggesting that the gain-of-function of P/Q-type Ca2+ channels facilitates the mechanisms of up-states generation and/or decreases the refractory period after an up-state. The first aim of my work was to further investigate the role of P/Q-type Ca2+ channels in the recurrent network activity underlying the up-states in WT mice. I studied the effect of pharmacological inhibition of P/Q-type Ca2+ channels on the up-state activity recorded from layer 2/3 pyramidal neurons in acute slices of mouse somatosensory cortex, by performing single and double patch clamp experiments. I found that the block of P/Q-type Ca2+ channels transforms the up-states into events resembling interictal epileptiform discharges. I evaluated the mean excitatory and inhibitory synaptic conductances (Ge and Gi) during the control up-states, during the simil-interictal epileptiform events after P/Q-type Ca2+ channels block as well as immediately after the application of the P/Q-type Ca2+ channels blocker when the channels were not completely blocked. I showed that 1) P/Q-type Ca2+ channels have a dominant role in controlling both excitatory and inhibitory synaptic transmission onto pyramidal cells during the spontaneous recurrent network activity that underlies the up-states. However, the block of P/Q-type Ca2+ channels reduces recurrent inhibition more than recurrent excitation and shifts the cortical excitation-inhibition balance towards excitation. 2) When, as a consequence of the block of P/Q-type Ca2+ channels, Ge/Gi increases above a critical value, the spontaneous network activity changes and the up-states are transformed into events resembling simil-interictal epileptiform discharges. These data suggest that, in the cerebral cortex, P/Q-type Ca2+ channels play a more prominent role in controlling inhibitory compared to excitatory synaptic transmission. Given that at many cortical synapses P/Q- and N-type (also known as CaV2.2) Ca2+ channels cooperate in controlling synaptic transmission, I also investigated the effect of blocking N-type Ca2+ channels on up-state activity. Pharmacological inhibition of this channel strongly reduces the up-states frequency, indicating a role for N-type Ca2+ channel in controlling up-states frequency. After the block of N-type Ca2+ channels, Ge/Gi increases but not sufficiently to transform up-states in simil-interictal epileptiform events. The aim of my second project was to investigate the unknown mechanisms underlying facilitation of experimental CSD in FHM2 KI mice. After setting the conditions in which facilitation of CSD was observed in vitro, I studied three possible mechanisms that may underlie the facilitation of CSD in heterozygous FHM2 KI mice, in acute slices of mouse somatosensory cortex. Given the specific localization and functional coupling of the α2 Na,K-ATPase to glutamate transporters in astrocyte processes surrounding cortical glutamatergic synapses (Cholet et al., 2002), I first investigated whether the loss-of-function of α2 Na,K-ATPase results in an impaired astrocyte-mediated clearance of glutamate from the synaptic cleft during cortical neuronal activity. I monitored the rate of glutamate clearance electrophysiologically, by measuring the synaptically-activated glutamate transporter-mediated current (STC) evoked in astrocytes of layer 1 by extracellular stimulation of neuronal afferents in the same layer. Either single pulse stimulation or trains of stimuli at high frequencies (50 and 100 Hz) were delivered. I isolated the STC pharmacologically in order to measure the STC decay time course that provides a relative measure of the glutamate clearance by astrocytes (Bergles and Jahr, 1997; Diamond and Jahr, 2000). I found that the clearance of glutamate release is slower in FHM2 KI compared to WT mice. The slowing of glutamate clearance was more pronounced after a train stimulation than a single stimulus and increased with increasing frequency of the train. My data show that the loss-of-function of α2 Na,K-ATPase results in an impairment of glutamate clearance and suggest that the impairment increases with increasing frequency of cortical activity. Surprisingly, the STC amplitude after a single pulse stimulation was higher in FHM2 KI than in WT mice. Given that the STC amplitude is proportional to the glutamate release evoked at the synapses by the extracellular stimulation (Bergles and Jahr, 1997; Diamond and Jahr, 2000), this result would suggest that the extracellular stimulation elicits a larger glutamate release in FHM2 KI than in WT mice. Indeed, during repetitive stimulation the STC depressed more in FHM2 KI than WT mice, as expected if the probability of glutamate release is increased in the mutant mice. Given the key role of NMDA receptors in the positive feedback cycle, that ignites CSD (Tottene et al., 2011; Pietrobon and Moskowitz, 2014), both the reduced clearance of glutamate and the increased glutamate release may be implicated in the facilitation of CSD in FHM2 KI mice. Given that most models of CSD include local increase of extracellular K+ concentration above a critical value, as a triggering event in the initiation of CSD (Pietrobon and Moskowitz, 2014), and that pharmacological evidence indicates that α2 and/or α3 Na,K-ATPase participate in the clearance of K+ from the extracellular space during intense neuronal activity (D’Ambrosio et al., 2002; Kofuji and Newman, 2004), I investigated whether K+ clearance by astrocytes is impaired in FHM2 KI mice. I evaluated the rate of K+ clearance from the interstitial space, by recording the slowly decaying current, which is mainly due to K+ influx through Kir channels, evoked in layer 1 astrocytes by extracellular stimulation. I measured the decay time course of this current, which provides an indirect measure of the K+ clearance rate by astrocytes. Preliminary experiments show that the decay time course of the K+ current evoked by train stimulation is similar in WT and FHM2 KI mice. If confirmed, this result would indicate that there are no changes in the rate of K+ clearance in FHM2 KI mice compared to WT. Given that α2 Na,K-ATPase is tightly coupled to the Na+/Ca2+ exchanger at plasma membrane microdomains that overlay the endoplasmic reticulum (Lencesova et al., 2004; Golovina et al., 2003) and hence its loss-of-function could influence Ca2+ homeostasis, we investigated whether the Ca2+ content in the intracellular Ca2+ stores of astrocytes in FHM2 KI mice is increased. We obtained an indirect measure of the amount of Ca2+ in the stores, by measuring in cultured cortical astrocytes the Ca2+ transient induced by ionomycin in Ca2+-free medium. This transient was larger in FHM2 KI mice compared to WT mice, indicating that the Ca2+ content is increased in the intracellular Ca2+ stores of astrocytes in FHM2 KI mice. I measured CSD threshold and velocity after depletion of intracellular Ca2+ stores by CPA, a SERCA inhibitor, and I observed that depletion of Ca2+ stores reduces the facilitation of CSD in FHM2 KI mice, without affecting CSD in WT mice. This result suggests a role of increased Ca2+ concentration within the astrocytes intracellular stores in the facilitation of experimental CSD in FHM2 KI mice.

L’emicrania è un disturbo neurologico comune e altamente invalidante, che colpisce più del 10% della popolazione, dovuto ad una disfunzione primaria del cervello che porta all’attivazione e alla sensibilizzazione episodica delle vie nocicettive trigeminovascolari. L’emicrania emiplegica familiare (FHM) è un rara forma di emicrania con aura considerata un buon modello per lo studio dell’emicrania; infatti gli attacchi tipici di FHM sono simili a quelli della normale emicrania con aura, eccetto per il sintomo dell’emiparesi (Pietrobon and Moskowitz, 2013). Mutazioni missenso con guadagno di funzione nel gene CACNA1A, codificante la subunità formante il poro dei canali del Ca2+ voltaggio dipendenti CaV2.1 (denominati anche canali del Ca2+ di tipo P/Q), causano FHM di tipo 1 (FHM1) e mutazioni con perdita di funzione nel gene ATP1A2, codificante la subunità astrocitaria α2 della Na,K-ATPasi, causano FHM di tipo 2 (FHM2) (Ophoff et al., 1996; De Fusco et al., 2003). Topi knock-in (KI) per le mutazioni che causano FHM1 e FHM2 presentano una facilitazione nell’induzione e nella propagazione della cortical spreading depression (CSD) (van den Maagdenberg et al., 2004, 2010; Leo et al., 2011), il fenomeno neurologico alla base dell’aura emicranica e un evento chiave innescante l’attivazione del sistema trigeminovascolare. Topi FHM1 KI per la mutazione R192Q, mostrano un aumentato influsso di Ca2+ attraverso i canali del Ca2+ di tipo P/Q e un aumento nella probabilità di rilascio di glutammato alle sinapsi piramidali della corteccia (Pietrobon, 2010; Tottene et al., 2009), che potrebbe spiegare la facilitazione della CSD sperimentale osservata in questi topi. Recentemente, nel nostro laboratorio, è stato dimostrato che la frequenza degli up-state registrati in fettine acute di corteccia, simili alle oscillazioni lente riportate in vivo (Steriade et al., 1993), è maggiore nel topo FHM1 KI che nel WT. Questo dato suggerisce che il guadagno di funzione dei canali del Ca2+ di tipo P/Q faciliti i meccanismi di generazione degli up-state e/o riduca il periodo refrattario dopo un up-state (Fabbro, Sessolo, Vecchia and Pietrobon, dati non pubblicati). Lo scopo della prima parte del mio lavoro è stato quello di approfondire il ruolo dei canali del Ca2+ di tipo P/Q nell’attività ricorrente di circuito alla base degli up-state nei topi WT. Ho studiato l’effetto dell’inibizione farmacologica dei canali del Ca2+ di tipo P/Q sulla attività ad up-state registrata da neuroni piramidali dello strato 2/3 in fettine acute di corteccia somatosensoriale di topo. Per questo scopo ho eseguito esperimenti di singolo e doppio patch clamp. Ho trovato che il blocco di questi canali del Ca2+ trasforma gli up-state in eventi che ricordano le scariche epilettiformi interictali. Ho analizzato le conduttanze medie eccitatorie ed inibitorie (Ge and Gi) durante gli up-state in controllo, durante gli eventi epilettiformi simil-interictali dopo il blocco dei canali del Ca2+ di tipo P/Q e nel periodo iniziale di applicazione dell’inibitore di questi canali, ovvero quando solo una parte dei canali era stata bloccata. Ho trovato che 1) i canali del Ca2+ di tipo P/Q svolgono un ruolo fondamentale nel controllare sia la trasmissione sinaptica eccitatoria sia quella inibitoria sulle cellule piramidali durante l’attività ricorrente di circuito sottostante gli up-state. Tuttavia, il blocco di questi canali riduce maggiormente l’inibizione ricorrente rispetto all’eccitazione, spostando di conseguenza l’equilibrio eccitazione-inibizione a favore dell’eccitazione. 2) Quando, come risultato del blocco dei canali del Ca2+ di tipo P/Q, il rapporto Ge/Gi supera un valore critico, l’attività spontanea di circuito cambia e gli up-state vengono trasformati in eventi simili alle scariche epilettiformi interictali. Questi dati suggeriscono che, nella corteccia cerebrale, i canali del Ca2+ di tipo P/Q svolgono un ruolo predominante nel controllo della trasmissione sinaptica inibitoria rispetto a quella eccitatoria. Dal momento che in molte sinapsi corticali, i canali del Ca2+ di tipo P/Q e di tipo N (denominati anche CaV2.2) cooperano nel controllare la trasmissione sinaptica, ho studiato anche l’effetto del blocco dei canali del Ca2+ di tipo N sull’attività ad up-state. L’inibizione farmacologica di questi canali causa una riduzione della frequenza degli up-state, suggerendo che i canali del Ca2+ di tipo N sono coinvolti nel regolarne la frequenza. Dopo il blocco dei canali del Ca2+ di tipo N, il rapporto Ge/Gi aumenta ma non sufficientemente a trasformare gli up-state in eventi epilettiformi simil-interictali. L’obiettivo della seconda parte del mio progetto è stato quello di studiare i meccanismi, ancora non noti, alla base della facilitazione della CSD sperimentale nel topo FHM2 KI. Dopo aver determinato le condizioni sperimentali in cui poter osservare la facilitazione della CSD in vitro, ho indagato tre possibili meccanismi che potrebbero spiegare la facilitazione della CSD nel topo eterozigote FHM2 KI, in fettine acute di corteccia somatosensoriale di topo. Dato lo specifico accoppiamento sia funzionale che strutturale negli astrociti tra la α2 Na,K-ATPasi e i trasportatori del glutammato a livello delle sinapsi corticali glutammatergiche (Cholet et al., 2002), ho verificato se la perdita di funzione della α2 Na,K-ATPasi compromettesse la rimozione, mediata dagli astrociti, del glutammato dalla fessura sinaptica durante l’attività neuronale. Ho pertanto valutato il tasso di rimozione del glutammato misurando elettrofisiologicamente la corrente attivata sinapticamente mediata dai trasportatori del glutammato (STC), indotta negli astrociti dello strato 1 attraverso la stimolazione extracellulare delle afferenze neuronali nello stesso strato sia con singoli impulsi che con treni di impulsi ad alta frequenza (50 and 100 Hz). Ho isolato farmacologicamente la STC, al fine di misurarne il tempo di decadimento che fornisce una misura relativa della rimozione del glutammato mediata dagli astrociti (Bergles and Jahr, 1997; Diamond and Jahr, 2000). Ho trovato che la rimozione del glutammato rilasciato è effettivamente più lenta nei topi FHM2 KI rispetto ai topi WT. Il rallentamento della rimozione del glutammato era più pronunciato dopo un treno di impulsi rispetto a dopo un singolo stimolo e aumentava all’aumentare della frequenza del treno. I miei dati dimostrano che la perdita di funzione della α2 Na,K-ATPasi compromette la rimozione del glutammato e suggeriscono che la rimozione del glutammato diventa più inefficiente all’aumentare della frequenza dell’attività corticale. Sorprendentemente, l’ampiezza della STC dopo un singolo stimolo era più grande nel topo FHM2 KI che nel topo WT. Dal momento che l’ampiezza della STC è proporzionale al rilascio di glutammato evocato alle sinapsi dalla stimolazione extracellulare (Bergles and Jahr, 1997; Diamond and Jahr, 2000), questo risultato potrebbe suggerire che la stimolazione extracellulare provoca un rilascio di glutammato maggiore nel topo FHM2 KI che nel topo WT. Infatti, durante stimolazioni ripetute, la STC deprime di più nel topo FHM2 KI che nel topo WT, come previsto nel caso di probabilità di rilascio di glutammato aumentata nel topo FHM2 KI. Considerato il ruolo chiave dei recettori NMDA nel ciclo di feedback positivo che innesca la CSD (Tottene et al., 2011; Pietrobon and Moskowitz, 2014), sia la ridotta rimozione del glutammato sia l’aumentato rilascio del neurotrasmettitore potrebbero essere implicati nella facilitazione osservata nel topo FHM2 KI. Visto che molti modelli della CSD includono un aumento della concentrazione extracellulare di K+ al di sopra di un valore critico, come un evento innescante la CSD (Pietrobon and Moskowitz, 2014), e alla luce delle evidenze farmacologiche che indicano che l’α2 e/o l’α3 Na,K-ATPasi partecipano alla rimozione del K+ dallo spazio extracellulare durante l’attività neuronale intensa (D’Ambrosio et al., 2002; Kofuji and Newman, 2004), ho indagato se la rimozione del K+ mediata dagli astrociti fosse compromessa nel topo FHM2 KI. Ho registrato elettrofisiologicamente la corrente sostenuta indotta negli astrociti dello strato 1 da stimolazione extracellulare; questa corrente è per lo più dovuta all’influsso di K+ attraverso i canali Kir e il suo tempo di decadimento fornisce una misura indiretta della velocità di rimozione del K+ mediata dagli astrociti. Questi esperimenti preliminari evidenziano che il tempo di decadimento della corrente di K+ evocata da treni di impulsi è simile nel topo FHM2 KI e nel topo WT. Se tale risultato venisse confermato, indicherebbe che non ci sono variazioni nel tasso di rimozione del K+ nel topo FHM2 KI rispetto al topo WT. Dal momento che l’α2 Na,K-ATPasi è strettamente accoppiata allo scambiatore Na+/Ca2+ a livello di microdomini di membrana sovrapposti al reticolo endoplasmatico (Lencesova et al., 2004; Golovina et al., 2003), abbiamo valutato se il contenuto di Ca2+ nei depositi intracellulari degli astrociti nel topo FHM2 KI fosse aumentata. Abbiamo ottenuto una misura indiretta della quantità di Ca2+ nei depositi andando a misurare negli astrociti corticali in coltura i transienti di Ca2+ indotti da ionomicina in un mezzo senza Ca2+. Il transiente di Ca2+ nel topo FHM2 KI era maggiore che nel topo WT, indicando un aumentato contenuto di Ca2+ nei depositi degli astrociti del topo FHM2 KI. Misurando la soglia e la velocita della CSD dopo aver svuotato i depositi di Ca2+ usando acido ciclopiazonico (CPA), un inibitore della SERCA, ho osservato che lo svuotamento delle riserve di Ca2+ riduce la facilitazione della CSD nel topo FHM2 KI, senza influenzare la CSD nel topo WT. Questo risultato suggerisce che l’aumentata concentrazione di Ca2+ all’interno dei depositi degli astrociti è coinvolta nella facilitazione della CSD sperimentale nel topo FHM2 KI.