Mathematical Modeling of Electrical Activity and Exocytosis in Intestinal L-cells and Pancreatic Beta-cells

In healthy subjects, glucose concentration is tightly kept in a limited range around its basal value thanks to complex regulatory mechanisms. Impairment of this regulatory system is the cause of several metabolic disorders, such as diabetes, characterized by chronic hyperglycemia, which leads to severe micro- and macrovascular complications. Different hormones are involved in this regulation, with insulin being one of the most important and well studied. It is physiologically secreted at every meal by pancreatic beta-cells in response to increased blood glucose levels, in order to lower glucose concentration. Other substances can stimulate insulin secretion, for example glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is an insulinotropic hormone released from intestinal L-cells in response to food ingestion. It is, together with other hormones, responsible for the so-called incretin effect, i.e., the fact that glucose ingested orally elicits a greater insulin response than glucose administered intravenously, even when glucose concentrations in plasma are matched. In type-2 diabetes, both insulin and GLP-1 secretion is impaired. In this context, a combination of experimental data and mathematical modeling could help in getting a deeper insight into the cellular mechanisms leading to the secretion of both hormones. In most of the excitable cells, the steps leading to secretion are quite similar: a trigger initiates the electrical activity in the cell, which leads to the opening of voltage gated calcium channels and a subsequent calcium influx inside the cell; the increase in calcium levels allows the vesicles to fuse with the plasma membrane and to release their content outside the cell. In this work, the different steps leading to secretion will be analyzed by means of a combination of both experimental data and mathematical modeling, with reference to the intestinal L-cells and the pancreatic beta-cells. Regarding the intestinal L-cells, a mathematical model of electrical activity was built to investigate the stimulus-secretion pathway, which is still poorly understood. However, two glucose-sensing mechanisms are known to contribute in the sensing of luminal glucose: the sodium-glucose cotransporters (SGLT) and ATP-sensitive K+-channels (K(ATP)-channels). The results showed how the two glucose-sensing mechanisms interact, and suggested that the depolarizing effect of SGLT currents is modulated by K(ATP)-channels activity. On the other hand, the stimulus-secretion pathway in pancreatic beta-cells is well established. SK-channels and calcium dynamics were included in a previous mathematical model of electrical activity in human beta-cells to investigate the heterogeneous and non-intuitive electrophysiological responses to ion channel antagonists. By using our model we also studied paracrine signals, and simulated slow oscillations by adding a glycolytic oscillatory component to the electrophysiological model. The model was further developed by including Kir channels, which play a critical role in the cardiac cells, by determining the shape of cardiac action potential. The inclusion of the Kir2.1 current in the model resulted in a clear improvement of the model behavior, by slowing down the spiking dynamics, thanks to the small outward Kir2.1 current, which tends to stabilize the inter-spike membrane potential. As a result of the beta-cell electrical depolarization, calcium channels open, leading to an influx and a subsequent diffusion of calcium inside the cell, which in turn triggers exocytosis. Hence, from the electrical activity analysis, we moved to the investigation of the relationship between insulin granule exocytosis, calcium levels, distance from calcium channels and channel clustering in beta-cells. This subproject is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy, consisting in simultaneous visualization of two different fluorophores. The first fluorophore is used to label insulin-containing vesicles, and to differentiate them into two groups: the ones that undergo exocytosis in response to depolarization, and the ones that do not. The second fluorophore, a genetically encoded calcium indicator (R-GECO), is attached to the plasma membrane and permits visualizing calcium levels during the stimulus. Simulations were performed using the modeling program CalC, which implements calcium diffusion and buffering. Simulated calcium levels and the corresponding R-GECO signal were evaluated at different distances from the channel. The comparison of the simulations to the TIRF microscopy data allowed estimating the average distance from the channel of the granules that undergo exocytosis. Calcium diffusion simulations were coupled to a simple model for insulin granule exocytosis to investigate different pools of granules, in terms of vicinity to the calcium channel and calcium affinity. Furthermore, the fusion probability was evaluated both in a single channel, and in a cluster-of-channels context. Simulations confirmed that the hypothesis of a cluster significantly increases the fusion probability and a certain dependence between the channels in the cluster is functional advantageous. So far we analyzed cellular mechanisms, which translate in insulin secretion. Hence, the natural step was to move from a cellular point of view to a bigger scale considering the whole pancreas. In this context, the so called minimal model approach might become useful, by allowing the determination of indexes to assess beta-cell function in different experimental groups. A minimal model specific for the perfused pancreas experimental setting was built adapting the C-peptide minimal model previously applied to the intravenous glucose tolerance test. The model was initially applied to untreated pancreata and afterward used for the assessment of pharmacologically relevant agents (GLP-1, the GLP-1 receptor agonist lixisenatide, and a GPR40/FFAR1 agonist, SAR1) to quantify and differentiate their effect on insulin secretion. Model application showed that lixisenatide reaches improvement of beta-cell function similarly to GLP-1 and demonstrated that SAR1 leads to an additional improvement of beta-cell function in the presence of postprandial GLP-1 levels. In conclusion, in this work different aspects of GLP-1 and insulin secretion were investigated by means of a combination of experimental data and mathematical models. Starting from the modeling of electrical activity in both L-cells and beta-cells, we moved to the calcium diffusion and exocytosis of insulin vesicles, concluding with a minimal model of insulin secretion.

In soggetti sani, il controllo della glicemia si basa su un complesso sistema di regolazione che permette di mantenere il livello di glucosio nel sangue all'interno di un range ristretto che oscilla attorno al suo valore basale. Malfunzionamenti in questo sistema di regolazione causano diversi disordini metabolici, tra cui il diabete, caratterizzato da una iperglicemia cronica, che può portare a gravi complicanze micro- e macro-vascolari. Diversi ormoni fanno parte di questo sistema di regolazione. L'insulina, che è uno dei più importanti e maggiormente studiati, è fisiologicamente secreta ad ogni pasto dalle beta-cellule pancreatiche, a seguito dell'aumento dei livelli di glucosio per diminuirli. Altre sostanze stimolano la secrezione di insulina, ad esempio il Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) è un ormone insulinotropico rilasciato dalle L-cellule intestinali in risposta all'assunzione di cibo. Assieme ad altri ormoni, è responsabile del cosiddetto effetto incretinico, ovvere la risposta insulinica maggiore per l’assunzione di glucosio orale rispetto alla somministrazione di glucosio endovenoso, anche nel caso in cui le concentrazioni nel plasma siano le stesse. Nel diabete di tipo 2 è ridotta sia la secrezione di insulina che di GLP-1. In questo contesto, i modelli matematici in combinazione con i dati sperimentali posso aiutare nell'ottenere una visione più approfondita dei meccanismi cellulari che portano alla secrezione di entrambi gli ormoni. Nella maggior parte delle cellule eccitabili, le fasi che portano alla secrezione sono piuttosto simili: l'attività elettrica, indotta da uno stimolo esterno, fa aprire i canali di calcio voltaggio dipendenti e causa un influsso di calcio all'interno della cellula; l'aumento dei livelli di calcio permette ai granuli di fondersi con la membrana plasmatica e rilasciare il loro contenuto all'esterno della cellula. In questo lavoro, le diverse fasi che portano alla secrezione verranno analizzate attraverso una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici, in riferimento alle L-cellule intestinali e le beta-cellule pancreatiche. Riguardo alle L-cellule intestinali, è stato sviluppato un modello matematico dell'attività elettrica per indagare il pathway stimolo-secrezione, che è ancora poco compreso. Tuttavia, è noto che due sono i meccanismi ritenuti responsabili della percezione del glucosio intestinale: il cotrasportatore sodio-glucosio (SGLT) e i canali potassio sensibili all'ATP (canali-K(ATP)). I risultati ottenuti hanno mostrato come i due meccanismi di percezione del glucosio interagiscono e suggeriscono che l'effetto depolarizzante delle correnti dovute ad SGLT è modulato dall'attività dei canali-K(ATP). Invece, il pathway stimolo-secrezione delle beta-cellule pancreatiche è noto. Per investigare alcune risposte elettrofisiologiche eterogenee e non intuitive ad antagonisti dei canali ionici, in un precedente modello matematico dell'attività elettrica nelle beta-cellule umane sono stati inseriti i canali SK e la dinamica del calcio. Utilizzando il modello sono stati studiati anche i segnali paracrini e, aggiungendo un oscillatore glicolitico al modello elettrofisiologico, sono state simulate anche le oscillazioni lente. Il modello è stato ulteriormente sviluppato includendo i canali Kir2.1, che svolgono un ruolo fondamentale nelle cellule cardiache, determinandone la forma dei potenziali d'azione. L'inserimento di questa corrente nel modello ne ha migliorato il comportamento rallentandone la dinamica. A seguito della depolarizzazione elettrica delle beta-cellule i canali di calcio si aprono permettendo l'influsso e la diffusione del calcio all'interno della cellula, che a sua volta causa l'esocitosi dei granuli di insulina. Per questo motivo, dall'analisi dell'attività elettrica, siamo passati allo studio nelle beta-cellule della relazione tra l'esocitosi dei granuli di insulina, i livelli di calcio, la distanza dai canali di calcio ed il clustering dei canali. Questo sotto-progetto è basato su dati di microscopia per fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), che consiste nella visualizzazione simultanea di due differenti fluorofori. Il primo è utilizzato per differenziare i granuli contenenti insulina in due gruppi, quelli che vanno incontro ad esocitosi e quelli che non lo fanno. Il secondo fluoroforo, un indicatore del calcio geneticamente codificato (R-GECO), è connesso con la membrana plasmatica e permette di visualizzare i livelli di calcio in quell'area durante lo stimolo. Le simulazioni sono state effettuate utilizzando il programma CalC, che permette di implementare la diffusione ed il buffering del calcio. Il confronto delle simulazioni con i dati di microscopia TIRF ha permesso di stimare la distanza media dai canali di calcio a cui si trovano i granuli che vanno incontro ad esocitosi. Le simulazioni di diffusione del calcio sono state accoppiate ad un modello dell'esocitosi per studiare i differenti gruppi di granuli, in termini di vicinanza ai canali di calcio ed affinità al calcio stesso. In questo contesto, la cinetica dei canali di calcio durante la depolarizzazione è stata simulata attraverso un sequenza stocastica ed un setup a canale singolo è stato confrontato con un setup di tre canali clusterizzati indipendenti o sincronizzati. Le simulazioni hanno confermato che l'ipotesi di un cluster di canali aumenta in modo significativo la probabilità di fusione e una certa dipendenza tra i canali risulterebbe funzionalmente vantaggiosa. Fino a questo momento, sono stati analizzati meccanismi cellulari, che si traduco nella secrezione di insulina. Quindi, un ulteriore passo è stato quello di spostarsi ad una scala maggiore considerando l'intero pancreas. In questo contesto, i cosiddetti modelli minimi possono essere un utile approccio, in quanto permettono di determinare degli indici per valutare la funzionalità beta-cellulare in differenti gruppi sperimentali. A partire dal modello minimo del C-peptide precedentemente applicato al test endovenoso di tolleranza al glucosio, è stato sviluppato un modello minimo specifico per il setup del pancreas perfuso. Il modello è stato inizialmente applicato a pancreas non trattati e, successivamente, utilizzato per la valutazione di importanti agenti farmacologici (GLP-1, lixisenatide, un agonista del recettore del GLP-1, e SAR1, un agonista del recettore GPR40/FFAR1), quantificando e differenziando il loro effetto sulla secrezione di insulina. I risultati hanno mostrato che lixisenatide ottiene un miglioramento della funzione beta-cellulare simile al GLP-1 e che SAR1 porta ad un miglioramento ulteriore della funzionalità beta-cellulare in presenza di livelli post-prandiali di GLP-1. In conclusione, in questo lavoro diversi aspetti della secrezione di GLP-1 e di insulina sono stati studiati con una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici. Iniziando dai modelli dell'attività elettrica sia nella L-cellule che nelle beta-cellule, siamo passati alla diffusione del calcio e all'esocitosi dei granuli di insulina, concludendo con un modello minimo della secrezione di insulina.