NITRATE SENSING BY MAIZE ROOTS: A KEY ROLE FOR NITRIC OXIDE SIGNALING IN THE TRANSITION ZONE

Over the past five decades, intensive agriculture has been able to increase the rate of food production more rapidly than that of human population growth but, at the same time, has also given rise to a series of negative environmental consequences, at both local and global level. Most of them are directly due to the large use in agriculture of synthetic ammonia fertilizers industrially produced by the Haber-Bosch process. Over 50% of the applied nitrogen in fact, is lost from the plant-soil system, leading to severe environmental damages and to negative impacts on human health. Maize (Zea mays L.) is one of the world’s major crops and is also expected to give an important contribution to human nutrition in the next few decades, when world population should exceed 8 billion people and rise to 9.2/11 billion by 2050. To ensure future global food security, increasing crop yields are dramatically needed, however, sustainable ways of crop production are far from being achieved, considering also that further nitrogen accumulation in the environment is expected to be increased in the future without an adequate enhancement of Nitrogen Use Efficiency (NUE) in the main crops. For this reason, the understanding of the molecular events underlying root adaptation to nitrogen fluctuations is a primary goal to develop tools for sustainable agriculture. Crop plant development in fact, is not only strongly dependent on nitrogen availability in the soil but also on the efficiency of its recruitment by roots. Plants take up and assimilate both nitrate and ammonium, but nitrate is the main source of inorganic nitrogen for plants in aerobic soil conditions typical of most cultivated soils. In addition to its role as a nutrient, nitrate acts as a signaling molecule regulating the expression of the genes involved in growth and developmental processes. However, the mechanisms governing the sensing of nitrate by roots and of the signaling leading to an altered development of roots are still only partially characterized. Nitric oxide (NO) has been recently proposed to be implicated in plant responses to environmental stresses, but its exact role in the response of plants to nutritional stress is still under evaluation. In this work, the role of NO production by maize roots after nitrate perception was investigated by focusing on the regulation of transcription of genes involved in NO homeostasis and by measuring NO production in roots. Moreover, its involvement in the root growth response to nitrate was also investigated. To better discriminate nitrate-specific effects from those more generally N-dependent, the expression of a number of genes previously identified as being nitrogen-responsive, was evaluated in response to nitrate/ammonium supply and deprivation. The transcriptional response of five genes encoding (i) the cytosolic nitrate reductase NR1, (ii) two different non-symbiotic hemoglobins (nsHbs) isoforms, (iii) a gene encoding nitrite reductase together with (iv) a gene encoding the high-affinity root nitrate transporter (NRT2.1), evidenced a very strong and exclusive nitrate responsiveness in roots. Conversely, no effects were observed when ammonium was supplied as the sole nitrogen source. This first screening allowed the current work to focus later only on genes whose expression seems to depend exclusively on nitrate and to be specifically involved in the control of NO biosynthesis and scavenging. Our results highlight the importance of the coordinate spatio-temporal expression of nitrate reductase and non-symbiotic hemoglobins in controlling the NO homeostasis in the maize root after nitrate provision. In addition, data obtained by analysing root morphological parameters by the WinRhizo software underlined the same specificity of nitrate, which significantly affected root growth when supplied to N-deprived roots. To deepen the hypothesis that nitric oxide may be produced by roots as an early signal of nitrate perception, NO in vivo detection was carried out. Results obtained using the DAF-2DA probe and stereo- and confocal microscopy evidenced a clear induction of fluorescence after nitrate provision. Very interestingly, the main zone of NO production seemed to be located immediately above the meristematic apex and more precisely to coincide with the root transition zone. The fluorescence detected after nitrate supply was not revealed in the presence of the specific nitrate reductase inhibitor tungstate, giving support to the role of NR in nitric oxide production. Moreover, the addition of the nitric oxide scavengers cPTIO together with nitrate, similarly suppressed the development of fluorescence, confirming the specificity of NO detection by the probe. These results suggest that a NR-dependent NO burst occurred immediately after nitrate supply to roots. The NR-dependent NO production observed after nitrate supply was then further confirmed by the strong induction of NR1, NiR, and nsHbs transcription in the early phases of nitrate perception. In this case also, the transcription was significantly inhibited in response to tungstate and cPTIO addition, endorsing the cooperation between nitrate reductase and haemoglobin activities in the finely tuned control of NO homeostasis. To deepen the spatial regulation of NO homeostasis balance, the expression of NR1, NiR and nsHbs genes was also analysed in four different root zones (i.e. meristem, transition zone, elongation zone, maturation zone) both in nitrate-depleted and in nitrate-treated seedlings. In N-starved roots, all transcripts evidenced their maximum accumulation at the meristem level. This pattern radically changed when nitrate was furnished to roots with a very significant increase of transcript abundance in the transition zone. As a result, we suggest that nitrate supply could activate its own sensing by stimulating NO production by the transition zone cells, thus initiating a signalling pathway contributing to the physiological adaptation (e.g. root growth) to nitrate fluctuations. Based on the preliminary results showing the preferential localization of NO production at the level of the transition zone, the attention was then focused on nitrate effects on root elongation, which takes place in the zone immediately above and neighbouring the transition zone. Our finding evidenced a strong and specific induction of root elongation of young maize seedlings supplied with 1 mM nitrate and a drastic inhibition in the presence of ammonium, cPTIO, and tungstate. On the contrary, when the negative control (-NO3-) was supplied with a NO donor (SNP) the root length increased significantly. These results strongly suggest that the NO generated through NR should significantly contribute to the root lengthening noticed after nitrate provision. To summarize, it would seem that the NO-mediated pathway here described represents an early alert system for external nitrate sensing by root cells, which seem to individually possess the competence to activate this pathway when external nitrate is perceived. Additional experiments are necessary to better understand the functioning of this NO-mediated pathway and to identify the downstream events that link the NO burst with the physiological redirection of root growth. In this regard, it has been reported that NO signaling can alter cell polarity and cytoskeleton-mediated vesicle trafficking processes, thus affecting cell growth and root morphogenesis. This suggests that there should be more downstream effectors of NO action, acting either in parallel or in series with cytoskeletal constituents. Furthermore, since NO and phytohormones auxin act synergically to control diverse aspects of root biology and also considering that lateral root development in response to nitrate is strongly auxin dependent, a role of NO as a coordinator of nitrate and auxin signaling to control the overall root response to the anion cannot be excluded. In order to try to answer to these last questions, in the final part of my Ph. D. thesis, we focused the attention on studying both cytoskeleton-mediated xyloglucans (a major primary cell wall component) modifications and polar auxin transport in the maize root transition zone cells in response to nitrate. Preliminary data achieved so far by using immunofluorescence labelling indicate that nitrate is able to modify cell wall recycling in the transition zone. Xyloglucans in fact, were very abundant especially in the sample subjected to nitrate treatment, when compared to the negative control, suggesting a higher rate of XGs synthesis /or recycling, in response to the anion in the maize root transition zone. Additionally, Brefeldin A (a chemical which prevents vesicle formation in the exocytosis pathway while allowing endocytosis, resulting in the cytoplasmic accumulation of all recycling molecules) treatment partially failed in removing all XGs from cell walls in +N samples, since a marked immunofluorescence was still visible at cross walls, despite the strong effect of the drug that resulted in the abundance of BFA-compartments also within these cells. These latter data could suggest that nitrate promotes a higher rate of XGs recycling in order to maintain a loosened cell wall structure, thus allowing an extensive and fast cell elongation in response to the anion. Taken together, these data open a fascinating scenario in which nitrate might act in promoting rapid cell elongation of root apex by regulating, in a mechanism as yet unknown, the synthesis or the turn-over (or both) of xyloglucans within root transition cells. Also PIN1-mediated auxin accumulation seems to be interfered in response to nitrate. IAA signal in fact, was strongly localized at the cross wall (end-poles) of transition zone cells only in nitrate-supplied roots, thus suggesting that IAA end-poles labelling was probably due to increased IAA fluxes triggered specifically by nitrate. In support to this hypothesis we also observed that IAA and its transporter PIN1 protein co-localize in NO3--treated roots at the cross walls (end-poles), thus providing further, although preliminary, evidences that nitrate in the maize root transition zone is able to increase IAA-fluxes, in a mechanism as yet unknown, that involved also PIN1 proteins. Further immunolabeling data, by also using NO donors and scavengers, will be needed to better understand the coordinated actions of nitric oxide, auxin and cytoskeleton adjustments in tightly regulating root motoric response to nitrate.

L’attuale modello di produzione agricola di tipo intensivo ha permesso di sfamare negli ultimi cinquanta anni una popolazione mondiale cresciuta in maniera esponenziale, ma, allo stesso tempo, è stato anche la causa dell’insorgere di preoccupanti problemi a livello ambientale, sia a scala locale che globale. Molti di questi problemi sono dovuti all’uso massiccio di fertilizzanti azotati di sintesi che derivano dal processo industriale Haber-Bosch. Mediamente più del 50% dell’azoto fornito come fertilizzante non è assorbito dalle colture, causando una catena di effetti negativi a livello ambientale che hanno come target finale la salute dell’uomo. Il mais (Zea mays L.) rappresenta già una delle principali colture agrarie e varie stime attribuiscono a questo cereale un ruolo alimentare fondamentale anche nei prossimi decenni, quando la popolazione mondiale dovrebbe assestarsi, secondo le proiezioni, tra i 9.2 e gli undici miliardi di abitanti. Parallelamente al raggiungimento dell’obiettivo della sicurezza alimentare, l’agricoltura è chiamata a produrre rese crescenti in maniera sempre più sostenibile a livello ambientale. Punto centrale per la ricerca in agricoltura, il miglioramento dell’efficienza di utilizzo dell’azoto (in inglese NUE, Nitrogen Use Efficiency) da parte delle colture agrarie, per garantire produzioni crescenti senza ulteriore accumulo di forme reattive dell’azoto nell’ambiente. Per questo motivo, la comprensione dei meccanismi molecolari e fisiologici che regolano l’adattamento dell’apparato radicale delle colture agrarie alle fluttuazioni delle concentrazioni di azoto nel terreno, rappresenta un obiettivo primario nell’ottica di un progressivo utilizzo di nuove tecnologie finalizzate ad una agricoltura più sostenibile. Il corretto sviluppo fisiologico di una coltura agraria non dipende, infatti, solo dalla disponibilità di azoto nel terreno, ma anche dall’efficienza d’intercettazione del nutriente da parte dell’apparato radicale. Le piante generalmente sono in grado di assimilare sia nitrato che ammonio tuttavia, nei suoli agrari ben aerati, la principale fonte di azoto è rappresentata dal nitrato. Negli ultimi anni numerosi lavori hanno evidenziato un ruolo del nitrato come molecola segnale, considerato che moltissimi geni coinvolti nei processi di sviluppo e di crescita della pianta sono regolati da questo anione. Tuttavia molti di questi aspetti rimangono ancora da decifrare nel loro insieme. Anche l’ossido nitrico (NO) si sta ritagliando negli ultimi anni un ruolo sempre più importante nell’ambito dello studio delle risposte delle piante agli stress. Tuttavia, il suo esatto ruolo in risposta agli stress nutrizionali è stato solo abbozzato. In questo lavoro è stata studiata in dettaglio la produzione di ossido nitrico che si registra nelle radici di mais in presenza di nitrato, concentrandosi inizialmente sullo studio della regolazione dei geni coinvolti nell’omeostasi dell’ossido nitrico. In un secondo momento è stato anche preso in esame il ruolo dell’ossido nitrico come attore chiave nel modulare differenti risposte morfologiche a livello radicale in presenza di nitrato. Per meglio discriminare eventuali effetti specifici delle varie forme di azoto a livello transcrittomico, l’espressione di un numero di geni in precedenza identificati per essere regolati dall’azoto è stata analizzata in condizioni di disponibilità/carenza sia di nitrato che ammonio. In particolare, il profilo trascrizionale di cinque geni, che specificamente esprimono (i) una nitrato reduttasi citosolica (NR1), (ii) due differenti isoforme di emoglobine di tipo non simbiotico (nsHbs), (iii) una nitrito reduttasi (NiR) e, infine, (iv) un trasportatore ad alta-affinità del nitrato (NRT2.1), ha evidenziato una risposta esclusiva al nitrato. Questi geni non hanno manifestano, infatti, variazioni significative nei livelli di espressione quando è stata utilizzato come unica fonte azotata l’ammonio. Questo primo screening è stato altresì importante perchè ha permesso di focalizzarsi nelle analisi successive solamente su quei geni che rispondono specificatamente al nitrato; gli stessi che hanno dimostrato poi, durante l’avanzamento della ricerca, essere anche quelli attivamente coinvolti nel controllo dell’omeostasi dell’ossido nitrico, e cioè la nitrato reduttasi e l’emoglobina. Questi primi risultati ci hanno permesso quindi di ipotizzare un modello di regolazione molecolare che vede coinvolti questi geni in un’azione coordinata responsabile della sintesi (NR) e rapida inattivazione (nsHb) dell’ossido nitrico, in quanto molecola estremamente reattiva e tossica per la cellula, in risposta al nitrato. In aggiunta, una serie di analisi morfologiche sulla radice elaborate grazie all’aiuto di uno specifico software (WinRhizo) ha evidenziato come il nitrato agisca anche in maniera specifica e differenziale sullo sviluppo dell’apparato radicale (sono stati presi in esame come indici radicali: (i) la lunghezza totale, (ii) la superficie totale, (iii) il diametro medio delle radici e (iv) il numero di apici laterali). L’ipotesi che l’ossido nitrico sia prodotto nelle radici in risposta al nitrato è stata vagliata successivamente per mezzo di una serie di misurazioni in vivo dell’ossido nitrico, usando come sonda specifica per l’ossido nitrico il composto DAF-2DA e misurando poi la fluorescenza (indice della presenza di ossido nitrico) negli apici radicali sia allo stereo microscopio che al microscopio confocale. I risultati ottenuti hanno confermato pienamente la teoria che suggerisce come l’ossido nitrico sia specificatamente sintetizzato dall’attività della nitrato reduttasi in presenza di elevate concentrazioni di nitrato. Le osservazioni al microscopio hanno inoltre evidenziato come la fluorescenza, indice della presenza dell’ossido nitrico, fosse massima e concentrata in una specifica area dell’apice radicale, e cioè la zona di transizione, situata tra l’apice meristematico e la zona di allungamento. Infatti successivamente, grazie all’utilizzo di un inibitore dell’attività dell’enzima nitrato reduttasi (tungstato) e del composto cPTIO (uno scavenger dell’ossido nitrico), l’ipotesi di partenza che prevede la sintesi dell’ossido nitrico legata all’attività della nitrato reduttasi in risposta al nitrato, e la rapida inattivazione da parte dell’emoglobina, è stata dimostrata e ulteriormente confermata anche dall’utilizzo di queste sostante in analisi di espressione genica, supportando pienamente l’ipotesi di una azione concertata di questi geni finalizzata alla regolazione omeostatica della sintesi/scavenging dell’ossido nitrico in risposta al nitrato. Una nuova serie di analisi è stata in seguito condotta nell’ottica di meglio caratterizzare eventuali differenze nei livelli di espressione di questi geni nelle diverse zone che compongono l’apice radicale. A questo proposito, l’espressione dei geni NR1, NiR e le due nsHbs, in risposta al nitrato, è stata analizzata specificatamente in quattro diverse zone della radice: (i) il meristema, (ii) la zona di transizione, (iii) la zona di allungamento e infine (iv) la zona di maturazione. In radici allevate in assenza di nitrato, il livello massimo di accumulo di trascritto per tutti i geni considerati si è concentrato nel meristema. In risposta al nitrato però, la zona di transizione ha registrato invece l’accumulo maggiore. In base a questi ultimi dati e allo studio della letteratura, suggeriamo l’ipotesi che il nitrato agisca nell’attivazione di una via di segnalazione che ha come risultato finale una risposta differenziale a livello morfologico della radice, per meglio rispondere alla presenza dell’anione nel terreno, e di come la percezione e l’attivazione di questa via di signaling avvenga specificatamente nella zona di transizione. Questa ipotesi non deve stupire, considerando la crescente mole di lavori che attribuisce a questa piccolissima zona dell’apice radicale un ruolo fondamentale nella percezione degli stimoli (sia interni sia esterni) e nella immediata traduzione in risposte adattive all’ambiente. Partendo da queste osservazioni, le analisi successive sono state focalizzate quindi allo studio degli effetti specifici che il nitrato esercita sulla regolazione della crescita della radice primaria, fenomeno che prende avvio a livello cellulare immediatamente a monte della zona di transizione e che gioca un ruolo cruciale nell’adattamento delle radici ai cambiamenti della disponibilità del nutriente nel suolo. L’analisi condotta ha evidenziato un effetto di stimolazione del nitrato nella crescita ma soprattutto ha confermato una probabile partecipazione dell’ossido nitrico in questo processo di induzione all’allungamento, considerando che l’aggiunta di cPTIO ad una soluzione nutritiva ricca di nitrato riduce la crescita. Parallelamente, l’aggiunta di un donatore di ossido nitrico (SNP) in una soluzione nutritiva questa volta priva di nitrato ha evidenziato coerentemente un effetto di stimolazione alla crescita. L’utilizzo di tungstato infine, che si è manifestato in un forte effetto di inibizione all’allungamento in plantule allevate in presenza della fonte di azoto, suggerisce ulteriolmente un ruolo chiave della nitrato riduttasi nella produzione di ossido nitrico in risposta al nitrato, e di come questo meccanismo di fine-tuning omeostatico abbia degli effetti a livello fenotipico. Per riassumere, questi dati collettivamente presi indicano come nella radice di mais esista una via di segnalazione in risposta al nitrato mediato dall’attività dell’ossido nitrico, in concerto con la regolazione omeostica garantita dall’azione condivisa della nitrato reduttasi e dell’emoglobina. Tuttavia nuove analisi si rendono necessarie per caratterizzare meglio questa via di signaling e scoprire nuovi attori che partecipano a valle della sintesi di NO in risposta al nitrato, e che intervengono infine nel modulare differenzialmente la morfologia della radice. A questo riguardo, molti studi suggeriscono di concentrare la ricerca sugli effetti dell’ossido nitrico a livello di modificazioni del citoscheletro, così come sulle interconnessioni tra l’ossido nitrico e l’ormone vegetale auxina. Partendo da queste ultime considerazioni, la parte finale del mio progetto di dottorato è stata finalizzata allo studio degli effetti che il nitrato esplica, specificatamente nella zona di transizione, sulla formazione della parete cellulare (un processo cellulare mediato dall’attività del citoscheletro) e delle emicellulose in particolare (xiloglucani). Inoltre, un’analisi preliminare è stata anche condotta per verificare gli effetti del nitrato sul trasporto polare dell’auxina. I risultati fin qui ottenuti dall’analisi immunochimica, suggeriscono come il nitrato abbia un effetto significativo nella regolazione del trafficking vescicolare degli xiloglucani nella zona di transizione. Infatti, questi costituenti di parete dai nostri primi dati, mostrano un più elevato tasso di sintesi o recycling in risposta all’anione. L’utilizzo dell’inibitore specifico del trafficking vescicolare Brefeldin A (BFA), ha confermato ulteriormente questa ipotesi. Questa ipotesi assegna al nitrato un ruolo di stimolazione del recycling vescicolare degli xiloglucani. Coerentemente con i dati precedenti che hanno mostrato un effetto di induzione del nitrato nella crescita della radice, un più elevato trafficking di materiale di parete può essere interpretato come un’azione per permettere alle pareti cellulari di distendersi maggiormente e di assecondare un più rapido sviluppo necessario per l’allungamento evocato dal nitrato. Infine, è stato visualizzato anche un effetto del nitrato riguardante il trasporto polare delle auxine mediato dai trasportatori PIN1 nella zona di transizione. In presenza di nitrato infatti, l’auxina si localizza preferibilmente a livello di cross-walls (end-poles), e questo effetto è specificatamente indotto dal nitrato. Questo dato è stato supportato anche dalle osservazioni sull’immunolocalizzazione dei trasportatori PIN1, che hanno mostrato di co-localizzare in risposta al nitrato negli stessi siti di accumulo (end-poles) precedentementi osservati per l’auxina. Nuove analisi sono necessarie per meglio inquadrare il ruolo giocato dall’ossido nitrico all’interno in questi processi cellulari, considerando le numerose interconnessioni che legano NO, auxina e citoscheletro nella regolazione delle risposte adattative della radice all’ambiente esterno.