Functional and structural analysis of [NiFe]- and [FeFe]-hydrogenases, the key enzymes for biohydrogen production

In recent years the problem of energy crisis has assumed such importance to promote research into sources of energy different from fossil fuels. In this context, molecular hydrogen represents a valid alternative because it is a renewable and clean energy resource since water is the only by-product of its combustion. The hydrogen production techniques currently used, however, require improvement in terms of performance and costs. A promising approach is to exploit biological photosynthetic microorganisms which, under suitable conditions, provide hydrogen from water and sunlight only. There are two main classes of enzymes involved in the metabolism of hydrogen: the [FeFe]- and [NiFe]-hydrogenases, both catalyze the reversible reaction 2H+ + 2e- ↔ H2, however [FeFe]-hydrogenases are more interesting for hydrogen bioproduction since they have a specific activity greater than [NiFe]-hydrogenases. Despite these two classes have different three-dimensional structures, different sequences and are phylogenetically distinct, they represent a clear example of convergent evolution since they catalyze the same reaction and have a similar catalytic site. In both cases, the assembly of the latter is a complex process: in the case of the [NiFe]-hydrogenases is driven by six proteins (HypA-F) and has been extensively studied and characterized. The maturation mechanism of [FeFe]-hydrogenases, instead, involves three maturases, HydE, HydF, HydG, and is less known. In particular, HydF, whose 3D structure has been solved in our laboratory (Cendron L. et al., 2011), is a GTPase protein and plays a central role in the maturation process. However, many functional details remain to be clarified, mainly due to the fact that its structure has been obtained in the apo form, completely lacking the cofactors. This gap is a limit for the development of biotechnologies that allow to express in vitro recombinant catalytically active [FeFe]-hydrogenases. Another unsolved issue concerns the biological role of hydrogenases, since these enzymes are inhibited by oxygen, but curiously they are expressed by microorganisms that live mainly in aerobic conditions. During the PhD I focused my experimental work mainly on two topics: first, the physiological role of the [NiFe]-hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803; secondly, the biochemical characterization of the GTPase domain of HydF. Synechocystis sp PCC 6803, unlike other cyanobacteria strains, holds only a bidirectional [NiFe]-hydrogenase. This enzyme has five subunits combined into two functional units: the hydrogenase portion, called HoxYH, that harbours the active site, and the diaphorase portion, called HoxEFU, which probably acts as a redox partner for the catalytic subcomplex. The physiological function of this enzyme is still under discussion: the general consensus is that it can play a role only under transient and/or specific growth conditions. It is interesting to note that, while being completely inactive in the presence of oxygen, the Hox protein is constitutively expressed in Synechocystis both in anaerobiosis and in aerobiosis, suggesting an additional function, besides hydrogen metabolism, at least in selected conditions. I generated several Synechocystis mutant strains, deleting individual or combinations of hox and hyp genes, encoding respectively for the hydrogenase subunits and for the proteins involved in the assembly of the active site, and analyzed their phenotype during prolonged, complete darkness in aerobiosis, a growth condition to which cyanobacteria are frequently exposed in nature. I found that the ΔHoxEFUYH knock out mutant strain, lacking the entire hox operon, has a notable reduction of growth when compared to the wild type strain. Since the hydrogenase function of the Hox protein is promptly inactivated by oxygen, we have assumed that the observed phenotype is not associated to its YH portion. This hypothesis has been explored by deleting genes coding for i) the HypA and HypB proteins, involved in the last steps of the hydrogenase maturation and for ii) the HoxYH portion, and evaluated their behavior under this environmental stress condition. We found that a correctly folded, functional [NiFe]-hydrogenase active site is indeed not essential to confer to Synechocystis the capability to face a prolonged darkness. To further characterize the wild type and the ΔHoxEFUYH mutant strain grown under these conditions we performed a quantitative proteomic analysis. The examination of the identified proteins showed that almost all the hydrophilic subunits of the respiratory chain complex I are downregulated in their expression. These results are consistent with previous independent studies in which [NiFe]-hydrogenase has been proposed to be functionally associated with the complex I (Cournac L. et al., 2004), and indicate that the entire electrons flow is altered when Synechocystis is grown under prolonged darkness, a condition in which both photosynthesis and respiration are affected. Therefore, the outcome of our research could provide a molecular evidence in support of the hypothesis that the [NiFe]-hydrogenase is functionally linked to respiratory chain, and more generally shed light on the expression and function of this enzyme under aerobic conditions. HydF is composed of three domains: the first is involved in the binding and hydrolysis of GTP, the second is the dimerization domain and the third is the FeS center binding domain. In the second part of this work, we have investigated the possible conformational changes induced by the binding of GTP, by expressing in Escherichia coli only the GTP binding domain of a recombinant HydF protein from Thermotoga neapolitana. In this domain we inserted, by site-specific mutagenesis, cysteine residues in positions useful for spectroscopic analysis. These residues were subsequently labeled with the thiol-selective spin-label MTSSL nitroxide. This probe, largely used in EPR spectroscopy, has allowed us first to study the local mobility of nitroxides at each mutated site, and then, by PELDOR spectroscopy, to analyze couple of residues labeled with the same technique. We found that the binding of the nucleotide does not induce large conformational effects within the isolated GTP domain. However, small variations were observed in the distances between the couple of labeled residues that could have diffused effect reflecting in the conformation of HydF. The results may add new insights into the role of GTP binding to HydF and its implications in the interaction of this protein with the other two maturases. With these studies we wanted to broaden the knowledge on the structure and function of hydrogenases, to gain a greater understanding of the mechanisms underlying their catalytic activity. This could in turn contribute to the development of biomimetic systems wherein optimize hydrogen production exploiting this class of enzymes

Negli ultimi anni il problema della crisi energetica ha assunto un’importanza tale da spingere la ricerca verso fonti di energia diverse dai combustibili fossili. In questo ambito l’idrogeno molecolare rappresenta una valida alternativa in quanto è una risorsa di energia rinnovabile e pulita dal momento che l’acqua è l’unico sottoprodotto della sua combustione. Le attuali tecniche di produzione dell’idrogeno, tuttavia, necessitano di miglioramenti in termini di rendimento e di costo. Una via promettente è quella biologica, che sfrutta microorganismi fotosintetici dai quali, in opportune condizioni, producono idrogeno solo con acqua e luce solare. Esistono due principali classi di enzimi coinvolti nel metabolismo dell’idrogeno: le [FeFe]- e le [NiFe]-idrogenasi, entrambe catalizzano la reazione reversibile 2H+ + 2e- ↔ H2, ma le [FeFe]-idrogenasi risultano più interessanti perchè presentano un’attività specifica superiore a quella delle [NiFe]-idrogenasi. Nonostante queste due idrogenasi abbiano sia strutture tridimensionali che sequenze differenti, e siano filogeneticamente distinte, rappresentano un chiaro esempio di evoluzione convergente in quanto, oltre a catalizzare la stessa reazione, hanno un sito attivo molto simile. L’assemblaggio di quest’ultimo è in entrambi i casi un processo complesso: nel caso delle [NiFe]-idrogenasi è regolato da sei proteine (HypA-F) ed è stato ampiamente studiato e caratterizzato. Il meccanismo di maturazione delle [FeFe]-idrogenasi, invece, coinvolge tre maturasi, HydE, HydF, HydG e non è ancora stato chiarito completamente. In particolare HydF, la cui struttura 3D è stata risolta nel nostro laboratorio (Cendron L. et al., 2011), è una proteina ad attività GTPasica e svolge un ruolo centrale in questo processo. Tuttavia, molti dettagli mancano ancora per definire con precisione la sua funzione, anche a causa del fatto che la sua struttura è stata risolta in forma apo, completamente priva di cofattori. Questa lacuna rappresenta un limite per lo sviluppo di biotecnologie che permetterebbero di esprimere in vitro [FeFe]-idrogenasi ricombinanti in forma cataliticamente attiva. Un altro tema irrisolto riguarda il ruolo biologico delle idrogenasi, dal momento che questi enzimi vengono inibiti dall’ossigeno, ma curiosamente sono espressi da microrganismi che vivono prevalentemente in condizioni aerobiche. Nel corso del Dottorato ho concentrato il mio lavoro sperimentale principalmente su due argomenti: il ruolo fisiologico della [NiFe]-idrogenasi nel cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803; la caratterizzazione biochimica del dominio GTPasico di HydF. Synechocystis sp PCC 6803, diversamente da altri ceppi di cianobatteri, possiede solamente una [NiFe]-idrogenasi bidirezionale. Questo enzima è composto da cinque subunità combinate in due unità funzionali: la porzione idrogenasica, chiamata HoxYH, che ospita il sito attivo, e la porzione diaforasica, chiamata HoxEFU, che probabilmente agisce come partner redox per il subcomplesso catalitico. La funzione fisiologica di questo enzima è ancora oggetto di discussione: il consenso generale è che può giocare un ruolo soltanto in condizioni di crescita specifiche e/o transitorie. È interessante notare che, pur essendo completamente inattiva in presenza di ossigeno, la proteina Hox è costitutivamente espressa in Synechocystis sia in anaerobiosi che in aerobiosi, suggerendo una sua funzione aggiuntiva, oltre al coinvolgimento nel metabolismo dell'idrogeno, perlomeno in condizioni selettive. Ho generato diversi ceppi mutanti di Synechocystis, eliminando singoli geni hox e hyp o combinazioni di essi, codificanti rispettivamente per la subunità idrogenasica e per le proteine coinvolte nell'assemblaggio del sito attivo, e ho analizzato il loro fenotipo in condizioni di crescita al buio completo e prolungato in aerobiosi e anaerobiosi, alle quali i cianobatteri sono spesso esposti in natura. Abbiamo riscontrato che il ceppo mutante knock out ΔHoxEFUYH, privo dell'intero operone hox, ha una notevole riduzione della crescita se confrontato con il ceppo wild type. Poiché la funzione idrogenasica della proteina Hox è immediatamente inattivata dall'ossigeno, abbiamo supposto che il fenotipo osservato non fosse collegato alla sua porzione YH. Questa ipotesi è stata esplorata eliminando i geni codificanti i) per le proteine HypA e HypB, coinvolte nell’ultima fase della maturazione idrogenasi e ii) per la porzione HoxYH, e valutando il loro comportamento in queste condizioni di stress ambientale. Abbiamo evidenziato che un sito attivo funzionale e correttamente assemblato non è indispensabile per conferire a Synechocystis la capacità di affrontare l’oscurità prolungata. Per caratterizzare ulteriormente il ceppo wild type e il mutante ΔHoxEFUYH cresciuti in queste condizioni abbiamo effettuato un’analisi proteomica quantitativa. L’esame delle proteine identificate ha dimostrato che quasi tutte le subunità idrofiliche del complesso I della catena respiratoria hanno ridotti livelli di espressione. Questi risultati sono coerenti con precedenti studi indipendenti in cui la [NiFe]-idrogenasi è stata funzionalmente associata al complesso I (Cournac L. et al., 2004) e indicherebbero che l'intero flusso di elettroni è alterato quando Synechocystis cresce in buio prolungato, una condizione in cui sia la fotosintesi che la respirazione risultano compromesse. Pertanto, l’esito delle nostre ricerche potrebbe fornire una prova molecolare a supporto dell’ipotesi che la [NiFe]-idrogenasi sia funzionalmente correlata alla catena respiratoria, e più in generale far luce sull'espressione e sulla funzione dell’enzima in condizioni aerobiche. La proteina HydF possiede tre diversi domini: uno coinvolto nel legame e idrolisi del GTP, uno di dimerizzazione e uno per il legame del centro FeS. Nella seconda parte del mio progetto abbiamo studiato le possibili variazioni conformazionali indotte dal legame del GTP, esprimendo in Escherichia coli il solo dominio di legame del GTP della proteina ricombinante HydF di Thermotoga neapolitana. In questo dominio abbiamo mutato dei siti ritenuti interessanti per la nostra analisi inserendo delle cisteine, che successivamente sono state marcate con lo spin-label MTSSL nitrossido, selettivo per i tioli. Questa sonda, ampiamente utilizzata in spettroscopia EPR, ci ha permesso in primo luogo di studiare la mobilità locale dei nitrossidi in ogni singolo sito mutato; in seguito, mediante spettroscopia PELDOR, abbiamo analizzato delle coppie di residui marcati con la stessa tecnica. Abbiamo scoperto che il legame del nucleotide non induce grandi effetti conformazionali all'interno del dominio isolato. Tuttavia, sono state osservate piccole variazioni nelle distanze tra i doppi residui marcati che potrebbero avere effetti diffusi e riflettersi nella conformazione di HydF. I risultati ottenuti potrebbero far chiarezza sul ruolo del legame del GTP a HydF e sulle sue implicazioni nelle interazioni di questa proteina con le altre due maturasi. Con questo studio abbiamo cercato di ampliare le conoscenze sulla struttura e sulla funzione delle idrogenasi per acquisire una maggiore comprensione dei meccanismi alla base della loro attività catalitica e dare un contributo per la messa a punto di sistemi biomimetici basati su questi enzimi, in cui massimizzare la produzione di H2