Analysis of Protein Kinase CK2 in B-lymphopoiesis and lymphomagenesis in a mouse conditional Knockout model

Serine-threonine protein kinase CK2 has been recently involved in the pathogenesis of B-cell tumors, such as B acute lymphoblastic leukemia, B chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma and multiple myeloma. CK2 acts through a “non-oncogene” addiction mechanism to propel tumor growth, protecting from apoptosis by a phosphorylation-dependent “shielding” mechanism of pro-survival molecules and stimulating oncogenic kinases by helping folding and enzymatic activity. In addition existing data on CK2 function in B-cell tumors suggest that this kinase might act as a “hub” downstream signals from surface membrane molecules, like the B-cell (BCR), growth factor and cytokine receptors, as well as from cell-intrinsic pathways – like proteotoxic and DNA-damage-related stress cascades. To gain insights into the role of CK2 in B-lymphopoiesis and, consequently, in B-cell tumors, we generated CK2β conditional knockout (KO) mice in B-cells by crossing CK2β-Flox/Flox mice with CD19-CRE transgenic mice. CK2 kinase activity was decreased in CK2β KO B-cells. In the bone marrow (BM), CK2β KO mice displayed a reduction of B-cells, especially of the recirculating population of transitional and follicular (FO) B-cells. Pro-B and pre-B-cell progenitors were slightly reduced in number. In peripheral blood, lymph-nodes, spleen and peritoneal cavity the number of B-cells was markedly reduced. CK2β KO mice displayed lower levels of all the immunoglobulin classes in the serum. In the spleen of CK2β KO we observed an imbalance between the amount of FO and marginal zone (MZ) B-cells was found with an absolute reduction of FO B cells by approximately 2-folds and an increase of MZ B-cells and MZB cell precursors by up to three folds. Histological and immunofluorescence (IF) analysis revealed a change of size/shape of spleen follicles and a significant expansion of the inter-follicular, marginal zone areas, which appeared to invade the follicle with larger cells. In vitro class-switch recombination assays demonstrated impairment in IgG1 and IgG3 class-switch and a marked reduction of the generation of antibody-producing cells. In vivo sheep red blood cells (SRBC) treatment (T-cell dependent response) showed a conserved up-regulation of germinal center (GC) markers, such as CD38, GL7 and PNA. Nonetheless, the architecture of the reactive follicles was found markedly changed. The analysis of FO, GC and MZ-associated genes showed normal levels of Bcl6, elevated levels of Lrf mRNA and, more significantly, a marked up-regulation of Notch2 target genes, such as hes1 and deltex1, in CK2β KO B-cells. In vivo Notch2 blockage with neutralizing antibodies markedly reduced the MZB cell number in CK2β KO mice, indicating a Notch2-dependent MZB expansion associated with CK2β loss. High throughput RNAseq analysis was also performed and revealed significant alterations in FOB and MZB-regulating pathways. Here, we found that the β subunit of protein kinase CK2 is a novel regulator of peripheral B cell differentiation. CK2β sustains a proper BCR signal, controls the GC reaction and negatively regulates Notch2 signaling, acting as a master regulator of follicular/marginal zone architecture and terminal homeostasis of FOB and MZB cells. On one side our data enrich the knowledge on the mechanisms regulating B-cell development, on the other side they inform about the potential mechanisms altered by CK2 during B-cell tumorigenesis.

CK2 è una serin-treonin chinasi pleiotropica costituita da due subunità α catalitiche e due subunità β regolatorie. Recentemente questa proteina è stata coinvolta nella patogenesi di neoplasie delle cellule B del sistema ematopoietico, come la Leucemia Linfatica Cronica (CLL), il Linfoma Mantellare (MCL) ed il Mieloma Multiplo(MM). CK2 agisce attraverso un meccanismo definito "non - oncogene addiction", favorendo la sopravvivenza delle cellule neoplastiche proteggendole dall’ apoptosi, attraverso la fosforilazione di proteine pro-sopravvivenza e stimolando chinasi oncogeniche attivando, in questo modo, la loro attività enzimatica. Alcuni studi inerenti il ruolo di CK2 nelle neoplasie di tipo B, suggeriscono che questa chinasi potrebbe agire a valle di recettori di fattori di crescita e citochine. Sulla base di questi dati, per ottenere maggiori informazioni sul ruolo di CK2 nella B-linfopoiesi e, di conseguenza, su un suo ipotetico ruolo nello sviluppo di neoplasie B, abbiamo generato un knockout (KO) condizionale della subunità β di CK2 esclusivamente nei linfociti B, incrociando topi CK2β Flox / Flox con topi transgenici CD19 - CRE. Mediante approfondite analisi abbiamo dimostrato che l'attività chinasica di CK2 risulta diminuita nelle cellule di topi CK2β KO. Nel midollo osseo, i topi KO evidenziano una riduzione delle cellule B, in particolare della popolazione di linfociti B ricircolanti, mentre l’analisi dei precursori dei linfociti B, cioè i pro-B e i pre-B, evidenzia che essi sono solo leggermente ridotti. In sangue periferico, milza e cavità peritoneale si ha una marcata riduzione dei linfociti B, in più i topi CK2β KO presentano nel siero una ridotta quantità di immunoglobuline di tutte le classi (ipogammaglobulinemia). Un’analisi approfondita dei linfociti B splenici ha evidenziato che nei topi CK2β KO si ha uno squilibrio tra la quota di linfociti B della zona follicolare (FO) ed i linfociti B della zona marginale (MZ). L’analisi istologica e l’immunofluorescenza, effettuate su milze di topi CK2β KO, hanno rivelato entrambe un cambiamento di dimensione/forma dei follicoli ed una significativa espansione della zona marginale, che sembra invadere il follicolo stesso. Attraverso un approccio in vitro abbiamo valutato lo switch isotipico, dimostrando che, nei topi CK2β KO, si ha una compromissione dello switch verso IgG1 e IgG3 ed una marcata riduzione della produzione di cellule secernenti anticorpi. In vivo, il trattamento con globuli rossi di montone (SRBC) ha mostrato una conservata regolazione di marcatori del centro germinativo (GC), quali CD38, GL7 e PNA; tuttavia, l'architettura dei follicoli nei topi CK2β KO presenta, rispetto ai topi di controllo, un evidente cambiamento architettonico/topografico. L'analisi, mediante Real-Time PCR, di geni associati alle zone follicolare e marginale, oltre che al centro germinativo, ha messo in luce, che i topi CK2β KO hanno livelli normali di bcl6 , elevati livelli di espressione di lrf e, soprattutto, una mancata up-regolazione di geni coinvolti nel pathway di Notch2, come hes1 e deltex1. Sulla base di quest’ultimo dato, abbiamo ritenuto risolutivo bloccare in vivo il recettore Notch2, mediante l’utilizzo di uno specifico anticorpo neutralizzante evidenziando, nei topi CK2β KO, una notevole riduzione del numero dei linfociti B marginali. Un’analisi “High-Throughput” , mediante RNA-seq, ha rivelato, nei topi CK2β KO, una significativa alterazione dei processi che regolano la formazione di MZB o FoB. Dai risultati di questo studio si può, quindi, ipotizzare che la subunità β della protein chinasi CK2 sia un nuovo regolatore del processo di differenziamento dei linfociti B periferici. Inoltre, CK2β sembra implicata nella corretta trasmissione del segnale a valle del BCR, nella reazione di formazione del GC e nella regolazione del pathway di Notch2. Possiamo, perciò, definirla un nuovo “master regulator” del differenziamento di FoB e MZB e della definizione dell’architettura topografica della zona marginale della polpa bianca splenica. In conclusione, i dati ottenuti con questo lavoro di tesi, da un lato arricchiscono la conoscenza dei meccanismi che regolano lo sviluppo dei linfociti B, dall'altro ci danno informazioni sui potenziali meccanismi su cui agisce CK2 durante lo sviluppo di neoplasie dei linfociti B.