Bone metabolism involvement in acute lymphocytic leukemia: the receptor Activator Nuclear Factor Kappa B Ligand pathway

This study begins with the clinical observation of muscolo-skeletal involvement in leukaemia. Bone metabolism alterations have been reported before diagnosis, and persist during therapy and follow up. The Receptor Activator Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), also known as CD254, represents the major pathway that regulates bone metabolism. This ligand can exist either as a soluble form either as membrane form (CD254). The ligand is expressed mainly by bone forming cells osteoblasts (OBs) and its receptor RANK is expressed by bone resorbing cells osteoclasts (OCs). Upon the binding of the ligand to its receptor osteoclasts precursor are induced to fuse into a multinucleate cell, able to resorb bone substrates. Flow cytometry analysis showed that membrane CD254 was up regulated in B ALL patients at diagnosis compared with control patients (Stop therapy and maintenance). Co-colture of CD14+ osteoclast precursors have been performed in order to assess the ability of CD14+ to fuse into multinucleate cells and eventually to resorb bone substrate. We evaluated the ability of a leukaemia cell line SEM, showing CD254 expression to influence CD14+ cells to differentiate and digest bone. Subsequently we co-coltured primary bone marrow cells from patients at diagnosis and controls and the ability to induce multinucleation of CD14+ cells were evaluated. Gene expression profile (GEP) was performed in order to see if RANKL involved pathways were altered in patients at diagnosis. We found that osteoclastogenic pathway, and osteoclast specific genes involved in osteopetrosis were down regulated. In this context of interaction we decided to focus on the cell communication through circulating membrane vesicles. Known with the generic term of extracellular vesicles (EVs), those can be isolated from the peripheral and bone marrow plasma. Here they have been isolated and analysed by flow cytometer for specific B leukemic (CD19), platelets (CD61) and bone (CD254) markers. The results showed that the overall number of EVs in peripheral blood plasma from diagnosis was reduced compared to the controls. Only few CD19+ vesicles were present in the peripheral blood plasma of diagnosis. In conclusion this study highlights the importance of the interaction between blasts cells and the bone metabolism, suggesting leukaemia can actively influence osteoclasts precursors.

Lo studio parte dall’osservazione che i pazienti pediatrici affetti da leucemia, presentano un interessamento osseo ancora prima della diagnosi e che persiste durante e dopo la terapia. La principale via regolatrice del metabolismo osseo è quella del Receptor Activator Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), anche noto come CD254. Questo ligando esiste sia in forma solubile sia di membrana (CD254). Il CD254 è espresso soprattutto dagli Osteoblasti (OBs), le cellule responsabili della formazione dell’osso, mentre il suo recettore, RANK, dagli Osteoclasti (OCs), le cellule deputate al riassorbimento. Gli osteoclasti degradano l’osso dopo l’attivazione attraverso il legame del RANKL. Altre cellule possono esprimere il RANKL e l’alta espressione del RANKL è associata alla capacità delle cellule di indurre osteolisi. L’analisi al citofluorimetro ha dimostrato che l’espressione della forma di membrana CD254 è up-regolata nei pazienti all’esordio B LLA Common rispetto ai controlli fuori terapia o a fine mantenimento. Mediante esperimenti di co-cultura è stata studiata la capacità dei blasti di influenzare il differenziamento dei precursori degli osteoclasti. E’ stata valutata quindi la capacità dei precursori CD14+ di fondersi a formare una cellula multinucleata, l’osteoclasto maturo, il quale in seguito diventa attivo e in grado di degradare la matrice ossea. La capacità di degradazione dell’osso è stata valutata usando una linea cellulare leucemica (SEM) esprimente il CD254, messa in co coltura con i CD14+. Le cellule coltivate in un terreno contenente frammenti di osso sono state in grado di degradare il substrato osseo. E’ stata poi valutata la capacità di multinucleazione da parte dei blasti da BM degli esordi ed esprimenti CD254 rispetto a quella dei controlli. Si è visto che l’alta espressione del RANKL sui blasti CD19+ dei pazienti alla diagnosi induce multinucleazione dei CD14+. Inoltre studi di Gene Expression Profile (GEP) sono stati fatti per valutare se ci fosse un’alterazione dei geni coinvolti nell’osteoclastogenesi e nell’osteopetrosi e alcuni di questi sono risultati down regolati in modo significativo. In questo network d’interazioni cellulari abbiamo voluto studiare un aspetto della comunicazione cellulare che riguarda le Microvescicole circolanti o “Extracellular Vesicles” (EVs). Le EVs sono state caratterizzate al citometro per l’espressione di marcatori di leucemia (CD19), piastrine (CD61) e per il metabolismo osseo (CD254). I risultati indicano che la produzione di EVs negli esordi dei pazienti B ALL è down regolata e che solo poche vescicole esprimono il CD19. Nel complesso questi dati suggeriscono che esiste un coinvolgimento diretto dei blasti nella via che regola il metabolismo osseo e che i blasti possono influenzare gli osteoclasti.