Gamma-glutamyl cycle in plant's adaptation to environment

This thesis work focusses on the gamma-glutamyl cycle in plants, with the aim to address the physiological significance of this cycle in plant adaptation to the environment. It is composed of three sections, where different approaches have been developed to understand different aspects of the cycle. In consideration that alternative and converging strategies may provide tools for deciphering plant metabolism,two main approaches were adopted: the application of stress conditions, and the use of mutants. In the first work, integrated biochemical, immunocytochemical, and quantitative proteomics analyses were performed in leaves of Arabidopsis thalianaggt1 knockout mutant (lacking apoplastic GGT1 isoform) and itscorresponding wild-type (WT). The ggt1 knockout leaves exhibited an increased ascorbate and GSH content, increased apoplastic GSH content, and enhanced protein carbonylations in the low-molecular-weight range compared to WT. Proteome data showed that disruption of gamma-glutamyl cycle in ggt1 knockout-leaves was associated with the induction of genes encoding four GSTs, a GSH peroxidase (GPX1), and glyoxylase II, suggesting that GGT1 plays a role in redox signaling. The disruption of the gamma-glutamyl cycle in the ggt1 mutant results in pleiotropic effects related to biotic and abiotic stress response, antioxidant metabolism, senescence, carbohydrate metabolism and photosynthesis, with strong implications for plant’s adaptation to environment. The objective of the second contribution wastounderstand how the ggt1 mutant line responds when it is exposed to an external oxidative stress by UV-B radiation. The response of ggt1 knockout Arabidopsis leaves to UV-B radiation was assessed by investigating changes in extracellular glutathione and ascorbate content and their redox state, and in apoplastic protein composition.Results show that, upon UV-B exposure, soluble antioxidants are altered in both genotypes. Rearrangements occur in their apoplastic protein composition, both in the wildtype under UV-B and in the ggt1 mutant in physiological conditions. This suggeststhe involvement of H2O2, which may ultimately act as a signal. I argue that oxidative stress conditions imposed by UV-B and disruption of the gamma-glutamyl cycle result in similar stress-induced responses, to some degree at least. Since the gamma-glutamyl transferase operates in the extracellular space, aim of the third contribution was to better investigate the reactions involvingLMW thiols (glutathione,cysteine and cysteinyl-glycine), metals and enzymes related to ROS metabolism in the cell wall. Resultsindicate that LMW thiolsexhibit quenching capacity for reactive oxygen species generated in the apoplastic spaceandpoint to a role for LMW thiols, which are metabolically related to each other in the gamma-glutamyl cycle, in modulating redox reactions in plant cell walls.

L’argomento della mia tesi di dottorato è stato il ciclo del gamma-glutammile nelle piante con lo scopo generale di investigare il significato fisiologico di questo ciclo nell’adattamento delle piante all’ambiente. Il lavoro è composto da tre contributi sperimentali, nei quali differenti approcci sono stati adottati per capire diversi aspetti del ciclo. Quando si vogliono approfondire le conoscenze per decifrare il metabolismo si possono usare strategie alternative e convergenti, due sono i principali approcci che sono stati adottati: sono stati imposti degli stress ossidativi esterni per valutare la risposta della pianta e si è fatto uso di mutanti. Nel primo lavoro, sono state eseguite analisi biochimiche, immunocitochimiche e proteomiche in foglie di Arabidopsis thaliana del mutante ggt1 (mancante dell’isoforma apoplastica di GGT1) e nel corrispondente wild-type (WT). Comparando le foglie wild-tipe con il mutante ggt1,quest’ultimo presentava un incremento del contenuto di ascorbato e glutatione, anche il GSH apoplastico risultava aumentato e un cambiamento nelle carbonilazioni delle proteinea basso peso molecolare. I dati proteomici evidenziavano che l’interruzione del ciclo del gamma-glutammile nelle foglie del mutante ggt1 era associato con l’induzione di geni codificanti per quattro glutatione-sulfo-transferasi (GSTs), una glutatione perossidasi (GPX1), e la gliossilasi II, suggerendo che la proteina GGT1 ha un ruolo nel redox signaling. Quindi l’interruzione del ciclo del gamma glutammile nel mutante ggt1 porta ad effetti pleiotropici legati alla risposta a stress biotici e abiotici, altera il metabolismo degli antiossidanti, la senescenza, il metabolismo dei carboidrati e la fotosintesi, con forti implicazioni nell’adattamento delle piante all’ambiente. L’obiettivo del secondo contributo era capire come il mutante ggt1 risponde quando è esposto ad un stress ossidativo esterno, è stato scelto di usare la radiazione UV-B. La risposta del mutante ggt1alla radiazione UV-B è stata valutata investigando i cambiamenti nello spazio apoplastico della composizione proteica e del contenuto di glutatione e ascorbato e il loro stato redox. I risultati evidenziano che, l’esposizione all’UV-B, altera gli antiossidanti solubili in entrambi i genotipi. I riarrangiamentiche avvengono nella composizione proteica dell’apoplasto, nel wild-type sottoposto a UV-B e nel mutante ggt1 in condizioni fisiologiche, suggeriscono un coinvolgimento del perossido di idrogeno (H2O2), il quale potrebbe agire come segnale. Questo mi porta a dedurre che le condizioni di stress ossidativo (imposte con l’UV-B) a l’interruzione del ciclo del gamma glutammile,in una certa misura, portano a una simile risposta indotta da stress.Poichè la gamma-glutammil transferase agisce nello spazio extracellulare, scopo del terzo contributo è stato investigare le reazioni che avvengono tra i tioli a basso peso molecolare (glutathione, cisteina e cisteinil-glicina), i metalli e gli enzimi legati al metabolismo dei ROS nella parete cellulare. I risultati indicano che i tioli LMW sono in grado di quenchare le specie attive dell’ossigeno generate nell’ apoplasto e evidenziano un ruolo per i tioli, i quali sono metabolicamente correlati tra loro nel ciclo del gamma-glutammile, nel modulare le reazioni redox nella parete cellulare.