Design, characterization and validation of an innovative biosensor for illegal hypertrophy treatments detection in cattle breeding.

The work done during this PhD program, and presented in this thesis had the goal to design, develop and characterize a system for the detection of illegal anabolic treatments in cattle breeding, independently from the particular anabolic substance used. The system is aimed to allow for faster and cheaper controls with respect to standard techniques such as mass spectrometry, gas chromatography, and histological exams. Moreover, the system allows for on-the-field controls, drastically reducing the costs related to sample transportation, analysis, and trained personnel. The main strength of this system is the independence of the anabolic treatments detection, from the particular substance employed, which makes this system optimal as screening method. Then, once identified the animals which has been treated, further analysis can be performed by standard techniques for the anabolic substance identification and quantification. The independence from the anabolic substance is achieved by adopting a novel paradigm for anabolic treatments detection, based on the identification of a common hypertrophic effect induced by the anabolic substance on an in-vitro culture of mouse myogenic cells. The cells provided with the anabolic substances receptors, are engineered to react to the hypertrophic stimulus with the over-production of lactate, which is then released in the cell medium. Then, the lactate concentration in the medium is detected by an electrochemical enzyme-based biosensor, which allows for a rapid and precise quantification by a cheap and miniaturizable device. The quantification of lactate produced by the engineered cells allows the detection of on-going hypertrophic effect and thus of the presence of anabolic substances in the biological sample collected from the cattle.

Il lavoro svolto durante questo dottorato di ricerca e riassunto in questa tesi ha avuto l'obiettivo di progettare, realizzare e caratterizzare un sistema unificato per la rilevazione di trattamenti anabolizzanti sui capi di bestiame bovini da carne, indipendentemente dalla sostanza utilizzata per i trattamenti. La tecnologia ideata consente di effettuare gli esami in modo molto più rapido che con i sistemi tradizionali e direttamente sul campo, su campioni d'urina dell'animale. Il suo principale punto di forza è l'indipendenza dal tipo di sostanza utilizzata che la rende ottimale per essere utilizzata come tecnica di screening. Una volta individuati gli animali trattati mediante il sistema, sarà possibile andare ad identificare e quantificare la sostanza anabolizzante mediante le tecniche standard di analisi. Tale indipendenza è ottenuta cambiando il paradigma di rilevazione delle sostanze e basandolo sull'effetto ipertrofico che queste hanno in vitro su una coltura di cellule miogeniche. L'effetto ipertrofico attiva nella linea cellulare miogenica, dotata dei recettori per le sostanze anabolizzanti e geneticamente modificata allo scopo, la sovraproduzione di acido lattico, che viene rilasciato dalla cellula nel mezzo. Qui l'acido lattico viene quindi quantificato da un biosensore elettrochimico enzimatico, grazie al quale è possibile ottenerne una veloce e precisa quantificazione con un'apparato di misura economico e miniaturizzabile. La quantificazione della concentrazione di acido lattico prodotto dalle cellule consente, a ritroso, di individuare la presenza di sostanze anabolizzanti nel campione d'urina dell'animale.