Ejaculates in competition: a sperm race influenced by the seminal fluid?

ABSTRACT In the last forty years, the historical notion of monogamous females has been gradually eroded away, and female multiple mating is now look as a common and ubiquitous phenomenon in nature, triggering theoretical and experimental attention to its biological implications and evolutionary consequences. Sexual selection is the evolutionary process that favours the increase in frequency of the genes that confer a reproductive advantage to the individuals carrying them. Polyandry implies that sexual selection may persist even after the copulation up to the point of fertilization, and in some cases beyond. In this scenario, male mating not necessarily results in successful insemination, but depends on the outcome of post-copulatory sexual mechanisms influencing the fertilization success, namely cryptic female choice and sperm competition. Female choice is the possibility for females to non-randomly bias paternity, favouring the ejaculate of the best quality male, in order to maximize their fitness. On the other hand, male-male competition results in sperm competition when the ejaculates of two or more males compete to fertilize the same set of eggs, as it has been firstly defined by Geoffrey Parker. When ejaculates overlap in space and time, differences in characteristics that are key factors for the fertilization success may lead one ejaculate to overcome the rivals, generating differential males’ reproductive success. This mechanism, investigated in both externally and internally fertilizing species, is a powerful evolutionary force moulding an amazing variety of behavioural, morphological and physiological traits. Ejaculates are costly to produce and, thus, sperm expenditure drawns the attention for how males, to increase their reproductive success, may modulate their investment in response to different sperm competition levels. Sperm competition is expected to influence those traits driving sperm fertilization capabilities in a specific context. To date, theoretical and empirical studies have primarily and only focused on how sperm characteristics, i.e. number and quality, affect the fertilization success of competing males. Increasing evidence are suggesting that predictions on the outcome of sperm competition should not revolve only around the sperm component of the ejaculate. The seminal fluid often makes up a large part of an ejaculate and it may influence paternity success both directly and indirectly. Indeed, seminal fluid is already known to enhances sperm performance in several species as well as to indirectly influence paternity success, by decreasing female receptivity, increasing oviposition rate and forming mating plugs. Seminal fluids may also play a frontline role in sperm competition by directly affecting rivals’ sperm performance. For instance, in promiscuous ants and bees, seminal fluid incapacitates the sperm of rival males, while in other insects, it improves equally the survival of own and other sperm. This suggests that, unless a self/non-self-recognition mechanism evolves, the function of seminal fluid to enhance own sperm performance can be exploited by the sperm of rival males. In particular, when a male can his reproductive role while mating with a female, if advantaged or disadvantaged, he could strategically allocate his ejaculate to maximize the reproductive success. Theoretical analyses, still waiting for experimental tests, posit that selection should favour phenotypic plasticity in male expenditure on both sperm and seminal fluid components, specifically influencing that/those that affect more the ejaculate competitive weight. Clear evidence still lack, likely because, up to the present study, models and experimental works considered mostly internal fertilizers, where it is difficult to attribute sperm and seminal fluid to a specific individual. I overcame these problems by using as model species two fishes with external fertilization, the grass goby (Zosterisessor ophiocephalus) and the black goby (Gobius niger) as they show a similar mating system and comparable levels of sperm competition, but potentially differ in the likelihood for seminal fluid to influence competition contexts. In both species males display territorial-sneaker mating tactics, where sperm competition risk varies according to the tactic adopted, with sneaker males experiencing the highest level producing a great number of sperm and less seminal fluid than territorial males. In the grass goby, sperm quality, in terms of velocity, viability and ATP content, does not vary between tactics, whereas, black goby sneakers produce sperm that are faster, more viable and richer in ATP than territorial males. In these two species, the dynamics of mating are potentially a crucial factor influencing the role of seminal fluid on the outcome of ejaculates competition. Indeed, grass goby sneakers enter inside the nest and may release their ejaculates in close proximity to those of the territorial male and to eggs. Thus, in this species I expected that the seminal fluid might have a competitive weigh, mediating sneaker and territorial ejaculates interplay. By contrast, in the black goby, sneakers are forced to release their ejaculate at the nest entrance and, thus, the opportunity for the mixing of territorial males’ and sneakers’ ejaculates does not occur or it is rare. On the basis of these preconditions, my PhD project pointed to i) verify in both species when and how the seminal fluid affects sperm performances, in terms of velocity, viability of own and rival sperm, making combinations of sperm and seminal fluid within and between males adopting different tactics; ii) deepen, in the grass goby, the proximate mechanisms driving sperm and seminal fluid interplay; iii) evaluate if the results from sperm performance give reliable insights on their fertilization ability and on the outcome of ejaculates competition in nature. Therefore, I performed in vitro fertilization tests, applying the same experimental design used in sperm performance trials. Secondly, considering that the paternity success of the grass goby has been already investigated from natural nests in a previous work, I concentrated on the black goby. I evaluated the fertilization success in the field through artificial nests located in natural breeding sites, by using molecular parentage analyses. In the grass goby, I found that sneaker’s sperm increase their performance, both in terms of velocity and fertilization rate, in presence of territorial male’s seminal fluid, while the performance of territorial male’s sperm is decreased in presence of sneaker’s seminal fluid. Appropriate control experiments demonstrate that this effect is not mediated by a self/non-self recognition mechanism. Investigating the proximate mechanisms driving sperm-seminal fluid cross interactions, we found that sneaker’ and territorial male’s ejaculates differ in seminal fluid protein content (quantitatively and qualitatively) and even in sperm quality, with sneaker sperm showing an higher oxygen consumption rate, a parameter rarely measured in sperm quality analyses. The deepening of sperm-seminal fluid proximate mechanisms is just at the beginning but I highlighted how the non-protein fraction of the seminal fluid (<3kDa) is crucial for sperm performance (velocity), despite even the protein fraction indicate a minor influence. In this species, sperm velocity results are perfectly mirrored by in vitro fertilization tests, hence sperm velocity is a reliable indicator of ejaculate fertilization ability. Considering the paternity success recorded in the field during a previous work, it seems that it is the territorial males nest guarding that finally determines their fertilization success, and thus, the distance at which sneakers are forced to release their ejaculates. Indeed, territorial males fertilization success positively correlate with their body size. In the black goby, where the ejaculates of competing males are released far from each other, seminal fluid does not affect the sperm performances of rival males, as expected. Despite the seminal fluid of territorial males significantly enhances their sperm speed, still sneaker sperm are significantly faster, regardless the seminal fluid present. Results from in vitro fertilization tests, apparently do not mirror sperm performance, since sneaker and territorial males fertilization rates do not significantly differ, probably because the low number of trials. However, I evidenced that sneaker and territorial males sperm differ in their swimming mode, with territorial male sperm moving in a significantly more linear trajectory. As a consequence, it could take the same time to sneaker and territorial male sperm to travel the same distance, even if those of sneaker have an higher speed. The analysis of the paternity distribution of territorial males in the field suggests that the distance at which sneakers are forced to release their ejaculates determines the number of eggs they fathered, as in the grass goby. Indeed, preliminary results from artificial nests in the field indicate that snakers stole more fertilizations close to the nest principal entrance, lowering the territorial male fertilization success in that area, but less in the rest of nest ceiling. However, territorial males parentage success is unexpectedly low, respect to that registered in the grass goby and across other fish species with a similar mating system. In addition, we found in two of four analysed nests few embryos sired by a neighbour territorial male. If the result would be confirmed by further analysis, it implies that territorial males may occasionally adopt sneaking behaviours, probably depending on the level of ejaculates competition determined by nests availability and male density. The territorial mating role would not appear as favoured as in other species with alternative mating tactics, especially considering that sneakers visits more than one nest. Further studies should be addressed to the investigation of territorial male paternity success along the breeding season. In both species, the spatial context in which the competition between ejaculates occurs proved to be important. The distance at which rival ejaculates are released determines the opportunity for the rival seminal fluid exploitation, and, consequently influences the strategy to maximize the fertilization success: through the number and/or the quality of the sperm, or taking advantage of the seminal fluid of a rival-tactic male. The seminal fluid proven itself to be one of the factor that may tip the balance in the ejaculates competition scenarios, that need to be investigated with a comprehensive multidisciplinary approach.

RIASSUNTO Negli ultimi quaranta anni, è emerso che i sistemi di accoppiamento nel mondo animale sono di tipo promiscuo o poliandrico molto più frequentemente di quanto non si credesse, rendendo necessarie una serie di considerazioni sulle implicazioni biologiche ed evolutive derivanti in particolare dal fatto che, in molte specie, le femmine si accoppiano con più di un maschio. La selezione sessuale è quel processo evolutivo che promuove la trasmissione dei geni che avvantaggiano dal punto di vista riproduttivo l’individuo che li esprime. Un sistema di accoppiamento poliandrico, o promiscuo, implica che la selezione sessuale possa proseguire anche dopo l’accoppiamento, fino al momento della fecondazione, e in alcuni casi anche successivamente. In questo contesto, il successo di fecondazione di un maschio non corrisponde necessariamente al suo successo di accoppiamento, ma può essere influenzato dai meccanismi di selettivi post-copulatori, quali la scelta criptica femminile e la competizione spermatica. Il primo meccanismo si realizza quando una femmina è in grado di favorire, “scegliere”, l’eiaculato di un maschio rispetto a quello degli altri maschi con cui si è accoppiata, e la scelta è stata definita criptica perché avviene all’interno delle vie riproduttive femminili. La competizione spermatica è stata definita come la competizione tra gli eiaculati di due o più maschi per fecondare uno stesso gruppo di uova. Questo secondo meccanismo è stato studiato sia in specie a fecondazione interna che esterna, e spinge l’evoluzione di tutti quei tratti morfologici, comportamentali e fisiologici che possono avvantaggiare l’eiaculato di un maschio rispetto agli eiaculati rivali in un determinato contesto di competizione. La produzione di spermi e liquido seminale comporta dei costi, e i maschi possono variarne l’investimento per massimizzare il proprio successo riproduttivo a seconda del livello di competizione spermatica percepito. Gli studi sperimentali e i modelli teorici si sono da sempre concentrati su come la competizione spermatica possa modellare il numero e la qualità degli spermi prodotti. Recentemente, tuttavia, la ricerca scientifica ha mostrato come la competizione tra gli eiaculati possa coinvolgere anche il liquido seminale. Questo, infatti, spesso costituisce una parte consistente dell’intero eiaculato ed è fondamentale per il mantenimento e le prestazioni degli spermi. Inoltre, nelle specie a fecondazione interna, è stato dimostrato che può indirettamente influenzare il successo di fecondazione di un maschio spingendo ad esempio le femmine a deporre un maggior numero di uova, oppure riducendo la loro ricettività e tendenza a riaccoppiarsi per limitare la competizione con gli spermi di altri maschi. Solo negli ultimi anni è stata presa in considerazione la possibilità che il liquido seminale di un maschio potesse agire direttamente sul successo di fecondazione degli eiaculati rivali. Per esempio, uno studio comparativo ha dimostrato che nelle specie di api e formiche dove il livello di competizione è più alto, il liquido seminale di un maschio favorisce le prestazioni dei propri spermi, e in maniera minore quelle degli spermi dei maschi rivali. In altre specie di insetti, invece, il liquido seminale di un maschio aumenta allo stesso modo la performance di tutti gli spermi contemporaneamente presenti. Questi risultati indicano che quando non si realizza un meccanismo di riconoscimento self/no-self tra gli spermi e il liquido seminale, le sue proprietà potrebbero essere sfruttate anche dagli spermi degli altri maschi in competizione. Di conseguenza, se, al momento dell’accoppiamento, un individuo riesce a stimare il grado di competizione che dovrà fronteggiare, potrebbe strategicamente regolare l’investimento nell’eiaculato a seconda che si trovi in una posizione favorita o sfavorita. I modelli teorici più recenti indicano che l’investimento nell’eiaculato può essere modellato su entrambe le sue componenti, a seconda di quanto spermi e liquido seminale influenzino il successo dell’intero eiaculato in un determinato contesto di competizione. Prima di questo progetto, le prove sperimentali a supporto delle predizioni derivate dai modelli sono state poche e i risultati contrastanti, probabilmente perché sia la ricerca teorica che quella sperimentale si sono prevalentemente concentrate su specie a fecondazione interna, dove è difficile separare il contributo di spermi e liquido seminale e distinguere tra gli eiaculati in competizione. Nel mio progetto ho usato quindi come modello due specie di pesci Teleostei che presentano fecondazione esterna, il go, Zosterisessor ophiocephalus e il ghiozzo nero, Gobius niger, che hanno un sistema di accoppiamento simile e livelli di competizione spermatica confrontabili. In entrambe le specie i maschi adottano tattiche riproduttive alternative, con i maschi dominanti, territoriali, che scavano un nido all’interno del quale la femmina depone le uova, e i maschi opportunisti, sneaker, che cercano di sfruttare gli accoppiamenti dei maschi territoriali. I maschi sneaker, che si confrontano con un più alto rischio di competizione dovendo sempre competere almeno con l’eiaculato del maschio territoriale, producono un maggior numero di spermi e meno liquido seminale rispetto ai maschi territoriali. Nel go, le prestazioni degli spermi non differiscono tra le due tattiche, mentre nel ghiozzo nero gli spermi dei maschi sneaker sono più veloci, longevi e presentano un maggior contenuto in ATP. Le due specie costituiscono un buon modello anche perché il liquido seminale ha una diversa possibilità di entrare in gioco nella competizione tra gli eiaculati a causa di alcune differenze legate alle modalità di accoppiamento. Infatti, nel go, i maschi sneaker riescono ad entrare nel nido e a rilasciare il proprio eiaculato vicino a quello del maschio territoriale e alle uova e, di conseguenza, in questa specie il liquido seminale potrebbe avere un ruolo nell’influenzare la competizione tra gli eiaculati. Nel ghiozzo nero, invece, i maschi sneaker sono spesso costretti a rilasciare il proprio eiaculato all’ingresso del nido, e di conseguenza il poco liquido seminale prodotto va verosimilmente incontro ad una rapida diluizione, e il grado di interazione tra spermi e liquido seminale di maschi aventi tattiche opposte è di conseguenza minore rispetto a quanto non accada nel go. Dato questo scenario, il mio progetto di dottorato ha voluto i) verificare, nelle due specie, quando e come il liquido seminale influenzi la competizione tra eiaculati, incrociando spermi e liquido seminale di maschi aventi la stessa o la tattica opposta e misurando le prestazioni degli spermi come velocità, vitalità e tramite test di fecondazione in vitro; ii) approfondire i meccanismi prossimi di interazione tra spermi e liquido seminale nel go, dove il liquido potrebbe effettivamente pesare sulle prestazioni degli eiaculati di maschi aventi tattiche opposte; e iii) controllare, nel ghiozzo nero, se i parametri considerati per misurare le prestazioni di un eiaculato sono indicativi del suo reale successo di competizione, andando quindi a misurare il successo di fecondazione dei maschi territoriali sul campo, tramite nidi artificiali ed analisi di paternità. Nel go, questa distribuzione della paternità nei nidi naturali è già stata valutata in un precedente studio. Nel go, è stato dimostrato un effetto tattica-dipendente del liquido seminale. Gli spermi dei maschi sneaker sono più veloci e mostrano un maggior successo di fecondazione quando è presente il liquido seminale di un maschio territoriale, mentre gli spermi dei maschi territoriali mostrano prestazioni inferiori, per gli stessi parametri, in presenza del liquido di un maschio sneaker, sempre rispetto ai valori misurati con il proprio liquido seminale. Un appropriato esperimento di controllo ha escluso che questi risultati siano dovuti ad un meccanismo di riconoscimento self/no-self tra spermi e liquido seminale. L’indagine dei meccanismi prossimi alla base dell’interazione tra spermi e liquido seminale ha evidenziato che l’eiaculato differisce tra maschi aventi tattiche opposte sia nella composizione del liquido seminale, per quanto riguarda il contenuto e il profilo proteico (differenze qualitative e quantitative), sia nelle prestazioni degli spermi misurate in termini di tasso di consumo dell’ossigeno, un parametro metabolico importante ma raramente considerato. Inoltre, nonostante le analisi sulla funzionalità del liquido seminale siano solo preliminari, hanno già dimostrato come sia determinante la presenza della frazione non proteica (<3kDa) per la velocità degli spermi, nonostante anche la frazione proteica (>3kDa) contribuisca, seppur in maniera minore. In questa specie, le prove di fecondazione in vitro rispecchiano i risultati emersi dai dati di velocità degli spermi, che di conseguenza risulta un buon indicatore della competitività dell’eiaculato. Considerando quanto emerso da uno studio precedente sulla distribuzione della paternità nei nidi naturali, sembra che il successo di fecondazione dei maschi territoriali sia determinato in ultimo dall’efficacia della difesa del nido, e cioè da quanto riescono a tenere a distanza i maschi sneaker durante l’accoppiamento. Infatti, il loro tasso di paternità correla positivamente con le loro dimensioni corporee. Nel ghiozzo nero, dove un maschio sneaker rilascia il proprio eiaculato a distanza rispetto a quello del maschio territoriale, non emerge nessun effetto tattica-dipendente del liquido seminale. Nonostante il proprio liquido seminale migliori le prestazioni degli spermi nei maschi territoriali, gli spermi dei maschi sneaker rimangono ancora significativamente più veloci e vitali. Le prove di fecondazione in vitro non rispecchiano i dati emersi, e non emerge alcuna differenza significativa nel successo di fecondazione delle due tattiche, anche se questo potrebbe esser dovuto alla scarsa numerosità dei dati. Tuttavia, in questa specie gli spermi dei maschi territoriali presentano un moto significativamente più lineare rispetto ai maschi sneaker e quindi è possibile che il loro nuoto sia in realtà più efficace, e possano percorrere la stessa distanza nello stesso tempo, nonostante gli spermi degli sneaker siano più veloci. L’analisi della distribuzione della paternità su campo suggerisce che anche nel ghiozzo nero sia la distanza a cui gli sneaker rilasciano il proprio eiaculato a determinare il risultato della competizione tra gli eiaculati. Infatti, i primi risultati mostrano che il successo di fecondazione del maschio territoriale è minore in corrispondenza dell’entrata principale del nido, dove è più probabile che i maschi sneaker riescano ad avvicinarsi e fecondare parte delle uova. Il successo di fecondazione del maschio territoriale all’interno di un nido è comunque basso (<50%) se confrontato con quello del go (>70%) o di altre specie di pesci aventi un sistema di accoppiamento simile. Inoltre in due nidi, alcune uova sono risultate fecondate da maschi territoriali che difendevano nidi vicini. Apparentemente quindi i territoriali parassiterebbero occasionalmente i nidi di altri maschi aventi la stessa tattica. Se il risultato venisse confermato, la posizione dei maschi territoriali nella competizione tra eiaculati potrebbe non apparire più come il ruolo favorito, considerando che i maschi sneaker visitano sistematicamente più di un nido. In entrambe le specie, il contesto spaziale in cui si realizza la competizione risulta decisivo. Il grado di interazione tra gli eiaculati di maschi aventi tattica opposta determina la possibilità che il liquido seminale possa esser sfruttato nell’ambito della competizione. Ne risulta che, nel go, dove il livello di interazione è alto, si crei l’opportunità per un maschio di sfruttare il liquido di un maschio avente tattica opposta, mentre nel ghiozzo nero, dove l’interazione è minima, i maschi siano costretti ad investire nel numero e qualità degli spermi prodotti o nella difesa del nido, a seconda della tattica. Il mio progetto di dottorato dimostra che il liquido seminale può effettivamente influenzare la competizione tra gli eiaculati a seconda del contesto, e che uno dei principali fattori da tenere in considerazione è il grado di interazione tra eiaculati rivali. L’approccio multidisciplinare adottato ha permesso di fare luce anche sui meccanismi prossimi di interazione tra spermi e liquido seminale.