Ruolo dell'inibitore della trombina dabigatran nella crescita neoplastica

Background: venous thromboembolism, a common complication of several malignant diseases, is a cause of poorest prognosis for the patients with respect to patients suffering for thrombus manifestation only. This occurs in the presence of a hypercoagulability state caused by coagulation factor that activate a number of pathways involved in tumor progressions. Among this factors, thrombin, a serine-protease implicated in the coagulation of fibrin, showed several physiologic and pathologic features and controls several cellular functions, including mitogenesis, cell adhesion, and angiogenesis. All this cellular responses are mediated by the thrombin-induced activation of PAR-1, a protease activated receptor expressed on the membrane of different cell types. Dabigatran is a new oral anticoagulant used in clinics for venous thromboembolism that inhibits effects of thrombin in a reversible manner by directly binding thrombin and altering its conformation. Aim: This study aims to evaluate the modulatory effects of dabigatran on tumor progression induced by thrombin. Moreover, we aim to study the effects of dabigatran in the regulation of cell cycle and proliferation in different tumor cell lines and of the neoangiogenesis induced by thrombin, with particular emphasis on the expression of Twist and Gro-α. Materials and methods:the tumor cell lines MCF-7 and U87-MG, from breast cancer and glioblastoma, respectively, and the endothelial cell line HUVEC, were used to evaluatethe effects of dabigatran on thrombin-induced proliferation (MTS assay), cell cycle (propidium iodide, PI, and BrdU assay) and expression of p27 and cyclin D1 by western blot, both proteins involved in regulation of cell cycle. Cell death of cells under treatment with thrombin and thrombin + dabigatran was evaluated by flow cytometry with PI and anexinV. We also evaluated the expression of Twist and Gro-α on tumoral cell lines, treated as above described,by real time PCR and western blot. Furthermore, we evaluated the effect of dabigatran on chemiotaxis (boyden chamber) and cord formation on matrigel. Results: This study demonstrated that thrombin induced an increased proliferation, the upregulation of cyclin D1 expression and the downregulation of p27, a protein regulating the cell cycle by increasing the amount of cells in S phase, on MCF-7 cells, effects reversed by treatment with dabigratran. On the contrary, U87-MG cells showed a reduced proliferation and an increased escape from cell death, following thrombin treatment. With regards to the vessel formation, thrombin upregulates the mRNA and protein expression of Twist and Gro-α and enhanced chemiotaxis of MCF-7, U87-MG, and HUVEC cells and stimulated tube formations in HUVEC cells, all effects hampered by the treatment with dabigatrans. Discussion: Thrombin stimulates cell proliferation, migration of tumor cell and tube formation in HUVEC endothelial cell line. dabigatran reduced cell proliferation, by modulating the expression of cyclin D1 and p27, both proteins involved in cell cycle regulation. Furthermore dabigatran inhibited neoangiogenesis and migration by reducing the expression of Twist and Gro-α on tumor and endothelial cell lines, and significantly decreased tube formation and chemiotaxis. Our data indicated that dabigatran could be used not only as an anticoagulant, but also as an anti-proliferative and anti-angiogenetic drug to prevent tumor progression in patients suffering for different tumors.

Gli eventi trombotici rappresentano una complicanza frequente dei pazienti con malattia neoplastica e ne condizionano una prognosi peggiore rispetto a pazienti neoplastici senza eventi trombotici. Ciò può suggerire che lo stato di ipercoagulabilità presente in questi pazienti favorisce la progressione neoplastica. Tra i fattori della coagulazione in grado di modulare la progressione neoplastica c’è a trombina, una serin-proteasi il cui ruolo principale è la trasformazione del fibrinogenoin fibrina, tappa finale della formazione del coagulo. La trombina tuttavia è in grado anche di stimolareprocessi come la proliferazione, la migrazione, l’adesione cellulare, l’angiogenesi, e la metastatizzazione. Tutti questi processi indotti dalla trombina sono mediati dal PAR-1, un recettore attivato da proteasi che viene espresso sulla membrana cellulare. Il dabigatran, un anticoagulante di corrente impiego nel trattamento del tromboembolismo venoso, inibisce in maniera reversibile l’attività della trombina modificandone la conformazione e rendendola incapace di legare ed attivare PAR-1. Obiettivo dello studio è di valutarese dabigatran è in grado di annullare gli effetti della trombina sulla progressione tumorale. In particolare, sono stati valutati gli effetti della trombina e dabigatranin-vitrosulla regolazione del ciclo cellulare, sulla proliferazione di cellule tumorali, sulla motilità e sulla formazione di neo-vasi. Per lo studiosono state utilizzate cellule di adenocarcinoma mammario e cellule di glioblastoma, come pure gli effetti di trombina e dabigatran sono stati definiti anche su una linea di cellule endoteliali. Per valutare l’effetto sulla proliferazione e sulla regolazione del ciclo cellulare,sono stati utilizzati il test di proliferazione MTS, l’analisi citofluorimetrica e il western blot. La morte cellulare è stata quantificata al citofluorimetro con anessina V e PI. Con le medesime metodiche è stato valutato la neoangiogenesi indotta da trombina e gli effetti di dabigatran, valutando l’espressione di proteine coinvolte nel processo angiogenetico come Twist e Gro-α.Infine, mediante camera di Boydenè stato quantificato il ruolo di trombina e dabigatran sulla chemotassi come pure abbiamo valutato il processo di neoformazione vasale su Matrigel. Abbiamo osservato come trombina determini proliferazione di celluledi adenocarcinoma mammario MCF-7 e che questa proliferazione si accompagna ad elevata espressione della ciclina D1 unitamente alla diminuzione della proteina p27, molecole chiave nella progressione del ciclo cellulare. La presenza di dabigatran si è dimostrata efficace nell’antagonizzare la proliferazione indotta da trombina come pure l’espressione delle proteine coinvolte nel ciclo cellulare. Abbiamo inoltre dimostrato che la formazione di neovasi stimolata dalla presenza di trombina si accompagna ad un aumento significativo dell’espressione di proteine regolatrici della neoangiogenesi, Twist e Gro-α. Trombina si è dimostrata anche in grado di determinare chemoattrazione di cellule neoplastiche e endoteliali. Tutti questi effetti pro-tumorali indotti da trombina sono stati significativamente inibiti da dabigratan. Abbiamo pertanto confermato che la trombina è attiva in molti processi favorenti la crescita neoplastica, dalla proliferazione, alla migrazione, fino alla neoangiogenesi. Dabigatran, un inibitore della trombina,si è dimostrato efficacenell’antagonizzare tali effetti pro-neoplastici. Anche se i nostri dati dovranno essere confermati da osservazioni cliniche, l’impiego di dabigatran come anticoagulante in pazienti con cancro e trombosi potrebbe rivelarsi efficace anche nel contrastare la progressione neoplastica. Inoltre i nostri dati indicano nel recettore PAR-1 un possibile target di futuri farmaci antiproliferativi.