Cancer stem cells from epithelial ovarian cancer patients privilege oxidative phosphorylation, and resist glucose deprivation

Ovarian cancer is the fourth leading cause of cancer-related death in women and the leading cause of gynecologic cancer death. Moreover, it is regarded as a therapy resistant tumor, because it shows the formation of more aggressive recurrence of the primary tumor as a result of chemotherapy. This chemo-resistance is thought to be related to the presence of the Cancer Stem Cells (CSC). Tumor cells are characterized by a high glycolytic metabolism even in the presence of oxygen, the so-called Warburg effect; however, it is unclear whether this condition is also shared by CSC. We identified ovarian CSC, according to their co-expression of CD44 and CD117 markers, in 40 samples of ascitic effusions from ovarian cancer-bearing patients. We have analyzed phenotipic characteristics by investigating stemness marker expression by flow-cytometry, spheroid formation assay, tumorigenicity in vivo and gene expression in RT-PCR. For the analysis of metabolic characteristics, ovarian cancer cells were FACS-sorted in to CD44+CD117+ and CD44+CD117- cell populations and analyzed through specific metabolic gene-cards. Results were confirmed also through Western Blot for specific metabolic enzymes and functional assay of mitochondrial activity. We have demonstrated that CD44+CD117+ EOC cells presented high tumorigenicity and expressed stemness-associated markers and multidrug resistance pumps. Moreover, the CD44+CD117+ cell population overexpressed genes associated with glucose uptake, oxidative phosphorylation (OXPHOS), and fatty acid -oxidation, indicating higher ability to direct pyruvate towards the Krebs cycle. Consistent with a metabolic profile dominated by OXPHOS, the CD44+CD117+ cells showed higher mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production and elevated membrane potential, and underwent apoptosis upon inhibition of the mitochondrial respiratory chain. The CSC also had a high rate of pentose phosphate pathway (PPP) activity, which is not typical of cells privileging OXPHOS over glycolysis, and may rather reflect the PPP role in recharging scavenging enzymes. Furthermore, CSC resisted in vitro and in vivo glucose deprivation, while maintaining their CSC phenotype and OXPHOS profile. In this study, we show that a subpopulation of CD44+CD117+ EOC cells fulfilling the canonical properties of CSC does not preferentially exploit a glycolytic metabolism, privileging instead the mitochondrial respiratory pathway. These observations could explain the CSC resistance to anti-angiogenic therapies, and indicate this peculiar metabolic profile as a possible target of novel treatment strategies.

Il cancro all’ovaio viene considerato un tumore resistente alla terapia e questa farmaco-resistenza si pensa sia correlata alla presenza delle cellule staminali tumorali (CSC). Le cellule staminali tumorali sono una rara e piccola popolazione cellulare responsabile dell’insorgenza del tumore, del mantenimento della sua crescita, dei casi di recidive e metastasi, in seguito alla loro proprietà di farmaco-resistenza. Considerando queste premesse, è indispensabile caratterizzare queste cellule in modo da trovare un possibile bersaglio terapeutico e migliorare i risultati delle terapie attuali. Le cellule tumorali sono caratterizzate da un metabolismo altamente glicolitico anche in presenza di ossigeno, denominato “Effetto Warburg”. Poco si conosce riguardo al metabolismo delle cellule staminali tumorali, e soprattutto non è noto se l’effetto Warburg è una condizione condivisa. Questo progetto di ricerca si prefigge di: - caratterizzare le CSC nel campioni primari di liquido ascitico di cancro all’ovaio; - studiare il profilo metabolico delle CSC isolate, per identificare eventuali differenze con la controparte differenziata. RISULTATI: Inizialmente abbiamo identificato le CSC, secondo la co-espressione dei marcatori CD44 (il recettore dell’acido ialuronico), e CD117 [c-kit, recettore della citochina SCF (Stem Cell Factor)] in 40 campioni di liquido ascitico di cancro all’ovaio di pazienti in cura all’ospedale di Padova. Questa rara popolazione cellulare CD44+CD117+ è in grado di formare strutture sferoidali; è altamente tumorigenica in topi immunodeficienti; presenta farmaco-resistenza, dimostrata con trattamenti in vitro con farmaci solitamente utilizzati in clinica; ed è caratterizzata da un’alta espressione di geni codificanti: pathway di staminalità (Nanog, Oct4, Sox2), pompe o enzimi detossificanti, coinvolti nei fenomeni di farmaco-resistenza (ABCG2, MRP1, MRP2 e ALDH1A) e enzimi coinvolti nel fenomeno della transizione epitelio-mesenchimale, importante nei processi di metastasi (SNAIL1, SNAIL2, ZEB1, ZEB2, TWIST1). Complessivamente, questi risultati dimostrano che le cellule CD44+CD117+ rappresentano una popolazione con caratteristiche di staminalità. A seguito di questa caratterizzazione fenotipica, abbiamo studiato il profilo metabolico delle cellule CD44+CD117+, confrontandolo con quello della controparte non-staminale (CD44+CD117-). In primo luogo, abbiamo esaminato l’espressione di geni coinvolti in diverse importanti vie metaboliche, tra cui: il metabolismo del glucosio, il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), la catena di trasporto degli elettroni (ETC) nel processo della respirazione mitocondriale, la via dei pentoso fosfati (PPP), e la β-ossidazione degli acidi grassi. Le cellule CD44+CD117+ mostrano alti livelli di espressione dei geni associati alla glicolisi, e sono caratterizzate da una forte dipendenza dalla via dei pentoso fosfati e della β-ossidazione degli acidi grassi, dimostrata da una significativa diminuzione della loro vitalità in seguito a trattamento in vitro con due inibitori specifici delle due vie metaboliche (DHEA e Etomoxir rispettivamente). Inoltre le cellule CD44+CD117+ sono caratterizzate da un'alta espressione dei geni codificati enzimi coinvolti nel ciclo di Krebs e nella fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Questo risultato ci ha permesso di analizzare l'espressione di un enzima chiave del ciclo di Krebs, la piruvato deidrogenasi (PDH), fondamentale nel trasporto del piruvato dalla glicolisi alla respirazione cellulare. Abbiamo verificato livelli di espressione comparabili dell’enzima PDH nelle due popolazioni cellulari CD44+CD117+ e CD44+CD117-, mentre l’enzima PDHK1, che inattiva la piruvato deidrogenasi tramite fosforilazione, risulta meno espressa nella popolazione CD44+CD117+. Questi dati suggeriscono che nelle cellule staminali tumorali venga privilegiato il trasporto del piruvato verso i mitocondri, per catalizzare il metabolismo della respirazione mitocondriale. Alla luce di questi risultati, abbiamo studiato l’attività mitocondriale nella popolazione staminale e nella controparte non staminale. In particolare le cellule CD44+CD117+ sono caratterizzate da bassi livelli di ROS (specie reattive dell’ossigeno) totali, da alti livelli di ROS mitocondriali, da una iper-polarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale in seguito a trattamento con oligomicina (inibitore dell’ATP-sintasi) e da una drammatica diminuzione della vitalità cellulare in seguito a trattamento con inibitori specifici della catena di trasporto degli elettroni (ETC) (oligomicina inibitore dell’ATP-sintasi; rotenone inibitore del complesso I e antimicina inibitore del complesso III). Complessivamente, questi risultati ci hanno suggerito un modello sperimentale del profilo metabolico delle cellule staminali tumorali CD44+CD117+, le quali privilegiano la via della respirazione mitocondriale, a discapito della via glicolitica. Inoltre, abbiamo dimostrato che un trattamento in vitro e in vivo (2DG) di deprivazione di glucosio o blocco della via glicolitica seleziona una popolazione di cellule con caratteristiche di staminalità: incremento dell’espressione dei marcatori CD44 e CD117, farmaco-resistenza, tumorigenicità in vivo, formazion dii sferoidi in vitro ed espressione di geni convolti in pathway tipici delle cellule staminali. Questa popolazione cellulare ha mostrato una down-regolazione della maggior parte delle vie metaboliche, entrando in uno stato di quiescenza pur mantenendo livelli di espressione significativi dei geni codificanti enzimi del metabolismo ossidativo e iper-polarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale, nonché dell’attività dei mitocondri. A conclusione del progetto e come ulteriore dimostrazione del profilo metabolico ossidativo delle cellule staminali tumorali, contrario all’effetto Warburg sfruttato dalle cellule tumorali, abbiamo eseguito degli esperimenti in vitro con due farmaci che colpiscono le vie metaboliche della respirazione cellulare: Metformina e CPI-613. Metformina inibisce il complesso I della catena di trasporto degli elettroni ed è attualmente in uso in studi clinici come farmaco antitumorale promettente; CPI-613 è un farmaco innovativo che inibisce due enzimi chiave del ciclo degli acidi tricarbossilici, PDH e α-KGH. Trattamenti in vitro con questi farmaci hanno dimostrato una significativa diminuzione della vitalità delle cellule CD44+CD117+, fondamentale verifica della loro dipendenza da questo profilo metabolico. CONCLUSIONI: In questo studio abbiamo investigato il profilo metabolico delle cellule staminali tumorali, isolate ex-vivo da campioni di liquidi ascitici di pazienti con carcinoma ovarico, dimostrando che le CSC ovariche, a differenza delle cellule differenziate neoplastiche, sfuggono all’effetto Warburg, utilizzando preferibilmente una respirazione ossidativa. Questa osservazione può indicare nuove strade e nuove strategie per approcci di terapie mirate nei confronti delle CSC, alla luce delle peculiari caratteristiche del loro metabolismo.