The role of time in biological systems: a computational analysis ranging from molecular dynamics to biological network simulations.

Time is the main character of this thesis, and it has been used in many ways. Starting from molecular dynamics simulations to biological networks, time has been analysed under different light and roles. The main subjects characterizing this work are Von Hippel-Lindau syndrome and circadian rhythm, although a method for molecular dynamics simulations trajectory analysis is presented at the end. Several works are presented here, analysing different aspects of protein dynamics as well as pathway alterations depending on the time coordinate. The first work analyses the interaction between protein Von Hippel-Lindau (pVHL) and its main interactor, Hipoxya Inducibe Factor 1α by means of molecular dynamics simulations, investigating on a non-conventional proline hydroxylation event. As a result, we obtained that a specific hydrogen bond network rearrangement and improved electrostatic energy for hydroxylated P567 appear to be compatible with an increase in HIF-1α binding affinity. Sequence analysis also confirms P567 to be vastly conserved during evolution, indicating a possible role for this alternative, PHD-3 driven, post translational modification in pVHL–HIF-1α complex formation. The second work dealt with the same main subject, but investigated through biological network simulations, particularly with Petri net models. In this work, we presented a novel manually curated Petri Net (PN) model of the main pVHL functional pathways. The model was built using functional information derived from the literature. It includes all major pVHL functions and is able to credibly reproduce VHL syndrome at the molecular level. The reliability of the PN model also allowed in silico knockout experiments, driven by previous model analysis. Interestingly, PN analysis suggests that the variability of different VHL manifestations is correlated with the concomitant inactivation of different metabolic pathways. In the third work, investigating the structural role of flavin-adenine-dinucleotide (FAD) through molecular dynamics simulations, we analyzed the Drosophila melanogaster Cryptochrome crystal structure, elucidating how this large co-factor within the receptor could be crucial for CRY structural stability. The co-factor appears indeed to improve receptor motility, providing steric hindrance. Moreover, multiple sequence alignments revealed that conserved motifs in the C-terminal tail could be necessary for functional stability. The fourth work focused on the sequence impact on the modern folds. We shuffled the sequences of 10 natural proteins and obtained 40 different and apparently unrelated folds. Our results suggest that shuffled sequences are sufficiently stable and may act as a basis to evolve functional proteins. The common secondary structure of modern proteins is well represented by a small set of permuted sequences, which also show the emergence of intrinsic disorder and aggregation-prone stretches of the polypeptide chain. The last work presented here is a method to quickly analyse molecular dynamics simulations trajectories. The complexity related to their interpretation and analysis is still one of the major challenges for most users. In this work we introduce RING MD, which is able to identify the most important frames (PDB structures) and key residues that cause different conformers transitions, providing a simple interpretation useful for non-expert users. Comparison with the classical analysis of three MD simulations, Ubiquitin, T4 Lysozyme and T4 Glutaredoxin, confirmed RING MD results and effectiveness. At the end, time should not be considered simply as something entraining the environment, it is what indeed modifies systems and environment. Different systems simply change in different ways, because of different mechanisms, but the main driving force should always be considered time.

Il tempo è soggetto principale di questa tesi, ed è stato utilizzato in molti modi. A partire da simulazioni di dinamica molecolare a reti biologiche, il tempo è stato analizzato in diversi modi e con diversi ruoli. I principali temi che caratterizzano questo lavoro sono la sindrome di Von Hippel-Lindau e il ritmo circadiano, anche se un metodo di analisi di traiettorie di simulazioni di dinamica molecolare è presentato alla fine. Diversi lavori sono presentati qui, analizzando diversi aspetti della dinamica delle proteine, nonché alterazioni di pathway dipendenti dalla coordinata temporale. Il primo lavoro analizza l'interazione tra proteina Von Hippel-Lindau (pVHL) e il suo interattore principale, Hipoxya Inducibe Factor 1α mediante simulazioni di dinamica molecolare, indagando su un evento di idrossilazione di una prolina non convenzionale. Come risultato, abbiamo ottenuto che uno specifico riarrangiamento di una rete di legami a idrogeno e un incremento di affinità elettrostatica nel sistema contenente la P567 idrossilata sembrano essere compatibili con un aumento di affinità di legame per HIF-1α. Analisi di sequenza confermano anche che P567 è notevolmente conservata durante l'evoluzione, indicando un possibile ruolo per questa modificazione post trasduzionale dipendente dalla PHD-3, nella formazione del complesso pVHL-HIF-1α. Il secondo lavoro affronta lo stesso soggetto principale, ma studiato attraverso simulazioni di reti biologiche, in particolare con reti di Petri. In questo lavoro, abbiamo presentato in un modello curato manualmente di Petri Net (PN) I principali pathway funzionali di pVHL. Il modello è stato costruito utilizzando informazioni funzionali derivate dalla letteratura. Include tutte le funzioni principali pVHL ed è in grado di riprodurre in modo credibile la sindrome VHL a livello molecolare. L'affidabilità del modello PN ha permesso anche esperimenti di knockout in silico, guidata da precedenti analisi del modello. È interessante notare che l’analisi della PN suggerisce che la variabilità delle diverse manifestazioni VHL è correlata con l'inattivazione concomitante di diverse vie metaboliche. Nel terzo lavoro, concernente il ruolo strutturale del flavin-adenina-dinucleotide (FAD) attraverso simulazioni di dinamica molecolare, abbiamo analizzato la struttura cristallografica di Criptocromo di Drosophila melanogaster, per chiarire come questo co-fattore nei recettore potrebbe essere cruciale per la stabilità strutturale della proteina. Il co-fattore sembra promuovere la motilità del recettore, fornendo un effetto sterico. Inoltre, allineamenti multipli di sequenza hanno rivelato che i motivi conservati nella coda C-terminale potrebbero essere necessari per la stabilità funzionale. Il quarto lavoro concerne l'impatto che diverse sequenze hanno sui fold moderni. Abbiamo mischiato le sequenze di 10 proteine naturali e ottenuto 40 diversi e apparentemente non collegati fold. I nostri risultati suggeriscono che le sequenze ottenute sono sufficientemente stabili e possono fungere da base per evolvere proteine funzionali. La struttura secondaria comune di proteine moderne è ben rappresentata da un piccolo insieme di sequenze permutate che sottolineano anche l'emergere di disordine intrinseco e tratti di segmenti peptidici pro-aggregazione. L'ultimo lavoro qui presentato è un metodo per analizzare rapidamente traiettorie di simulazioni di dinamica molecolare. La complessità legata alla loro interpretazione e l'analisi sono ancora tra le principali sfide per la maggior parte degli utenti. In questo lavoro introduciamo RING MD, che è in grado di identificare i frame più importanti (strutture PDB) e residui chiave che causano transazioni tra diversi conformeri, fornendo una fonte di semplice interpretazione utile per gli utenti non esperti. Il confronto con l'analisi classica di tre simulazioni, ubiquitina, lisozima e glutaredossina di batteriofago T4, conferma l’efficacia di RING MD. Alla fine, il tempo non dovrebbe essere considerato semplicemente come spettatore passivo, ma effettivamente parte attiva nella modifica di sistemi e dell'ambiente. Diversi sistemi mutano in maniera diversa, a causa di diversi meccanismi, ma la principale forza motrice deve sempre essere considerata il tempo.