Botrytis cinerea transcriptomic response to the active substance eugenol and role of Snf1 kinase in fungal pathogenesis

Botrytis cinerea is a fungal pathogen causing grey mould on more than 240 dicotyledonous plants resulting huge economic losses. To control the disease in the field and to prevent post-harvest damages, frequent fungicidal treatments are required, thus increasing the risk of spread of resistant strains to fungicides and the negative effects on environment and human health. Therefore, new molecules with different mode of action or alternatives to fungicides should be introduced to better manage the disease, to better preserve the environment and to increase the food safety. Several groups of natural substances can be used as alternatives to synthetic fungicides and among these compounds, plant essential oils are largely experimented for their well known antimicrobial and antifungal activity. Eugenol is an effective compound of several essential oils, the main component of clove oil, which is extracted from clove buds and used as local antiseptic in traditional medicine. The mechanism of the antifungal effect of eugenol was examined on Saccharomyces cerevisiae and on some plant pathogenic fungi. The main described effects of this phenolic component seem to be the disruption of integrity of fungal cell membrane and cell wall; however the precise mode of action of eugenol is unclear. To address the mode of action of eugenol, transciptome analysis was performed using NimbleGen 4x72K arrays. Cultures of B. cinerea were treated with eugenol at the effective concentration (EC80 ) of 250 µg ml-1, and control (untreated) and treated mycelia were collected after 6 h and 12 h. The transcriptional response of B. cinerea to eugenol was statistically analyzed and the differentially expressed genes were evaluated. Significant enrichment of down-regulated genes was found in the ergosterol biosynthesis, DNA replication factors class, glutathione pathway, transmembrane transport, and botrydial toxin biosynthesis, while up-regulated genes were detected in several functional categories belonging to stress response. A modern approach to fungicidal development is a rational design of drugs mirrored to target fundamental node of the complex cellular network. In yeast, the Snf1 protein kinase is a global regulator and important in a glucose signalling pathway controlling the response to nutritional and environmental stresses. In order to characterize the role of B. cinerea Snf1 kinase, deletion mutants of the encoding gene were obtained and analyzed in vitro and in vivo. Δsnf1 mutants grew slower with a reduction of 20-80 % on simple sugars, polysaccharides, and on lipidic carbon sources at pH 5 and mostly at pH 7. The enzyme activity produced by a mutant strains was also measured and a significant reduction of xylanase activity and an increase of polygalacturonase activity were observed in comparison with the wild type. These results suggest that Snf1 kinase does not act as general activator of B. cinerea cell wall degrading enzymes but seems to be involved in a possible pH dependent regulation. In pathogenicity test, the virulence of the Δsnf1 mutants was reduced by 60-90 % in comparison with the wild type. Δsnf1 mutants were impaired in sporulation as well; in fact, they did not produce normal conidiophores with macroconidia, but only microconidia. In conclusion, B. cinerea Snf1 protein kinase regulates conidiation, carbon source utilization and strongly affects virulence; therefore it could be a possible target for new fungicides

Botrytis cinerea è un fungo patogenico che provoca muffa grigia su più di 240 piante dicotiledoni con conseguenti enormi perdite economiche. Per controllare la malattia in campo e per prevenire i danni post-raccolta, sono necessari frequenti trattamenti antiparassitari, aumentando così il rischio di diffusione di ceppi resistenti ai fungicidi e gli effetti negativi per l'ambiente e la salute umana. Pertanto, le nuove molecole con diversa modalità di azione o i fungicidi alternativi dovrebbero essere introdotti per gestire meglio la malattia, per preservare meglio l'ambiente e per aumentare la sicurezza degli alimenti. Diversi gruppi di sostanze naturali possono essere utilizzati come alternativi ai fungicidi di sintesi e tra questi composti, gli oli vegetali essenziali sono largamente sperimentati per la loro conosciuta attività antimicrobica e antifungina. L’eugenolo è un composto efficace per diversi oli essenziali, il componente principale di olio di garofano, che viene estratto dalle gemme dei chiodi di garofano e usato come antisettico locale nella medicina tradizionale. Il meccanismo dell'effetto antimicotico dell’eugenolo è stato esaminato in Saccharomyces cerevisiae e su alcuni funghi patogeni vegetali. I principali effetti descritti di questo componente fenolico sembrano essere la rottura dell'integrità della membrana cellulare fungina e della parete cellulare; tuttavia non è chiara la modalità precisa d'azione dell’ eugenolo. Per affrontare la modalità di azione dell’ eugenolo, l’analisi del trascrittoma è stata effettuata utilizzando matrici NimbleGen 4x72K. Le colture di B. cinerea sono state trattate con eugenolo alla concentrazione efficace (EC80) di 250 μg ml-1, e di controllo (non trattato) e i miceli trattati sono stati raccolti dopo 6 h e 12 h. E’ stata analizzata statisticamente la risposta trascrizionale di B. cinerea all’ eugenolo e sono stati valutati i geni differentemente espressi. E’ stato trovato un arricchimento significativo di geni down-regolati nella biosintesi dell'ergosterolo, nei DNA classe fattori di replica, nel percorso del glutatione, nel trasporto transmembrana e nella biosintesi della tossina botrydial, mentre i geni up-regolati sono stati rilevati in diverse categorie funzionali in merito a risposta da stress. Un approccio moderno allo sviluppo dei fungicidi è un disegno razionale di farmaci che rispecchiano il target come nodo fondamentale della complessa rete cellulare. Nei lieviti, la proteina chinasi Snf1 è un regolatore globale ed è un importante percorso di segnalazione del glucosio attraverso il controllo della risposta a stress nutrizionali e ambientali. Per caratterizzare il ruolo di B. cinerea Snf1 chinasi, i mutanti di delezione del gene codificato sono stati ottenuti e analizzati in vitro e in vivo. I mutanti Δsnf1 sono cresciuti più lentamente con una riduzione del 20-80 % su semplice zuccheri, polisaccaridi, e fonti lipidiche di carbonio a pH 5 e per lo più a pH 7. E’ stata anche misurata l'attività enzimatica prodotta da ceppi mutanti ed è stata osservata una significativa riduzione dell'attività di xilanasi e un aumento dell'attività della poligalatturonasi rispetto al tipo selvatico. Questi risultati suggeriscono che la Snf1 chinasi non agisce come attivatore generale degli enzimi che degradano la parete cellulare di B. cinerea ma sembra sia coinvolta in un eventuale regolazione dipendente dal pH. Nel test di patogenicità, la virulenza dei mutanti Δsnf1 è stata ridotta del 60-90 % rispetto al tipo selvatico. I mutanti Δsnf1 sono stati alterati in sporulazione pura; in realtà, essi non producono conidiofori normali con macroconidi, ma solo microconidi. In conclusione, la proteina chinasi Snf1 di B. cinerea regola la conidiazione, l’ utilizzo delle fonti di carbonio e influenza fortemente la virulenza; quindi potrebbe essere un possibile bersaglio per i nuovi fungicidi