Characterization of pUL5, an HCMV protein interacting with the cellular protein IQGAP1

Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous virus infecting the majority of adults worldwide. In healthy individuals, a strong immune response to HCMV is able to limit and contain the spread of the disease, although the virus is able to establish a lifelong lasting latency with recurrent and spontaneous reactivation. Acute disease is observed only in particular settings where the normal immune response of the patient is weak or compromised, such as in transplant or patients with Acquired Immuno-Deficiency Syndrome (AIDS) or in fetuses that acquire the infection congenitally. HCMV possesses the largest genome among herpesviruses and a lot of effort is being put on the study of the huge coding potential this virus displays in order to have a better understanding of the mechanisms behind its infection. In this work, we address the study of the protein product of UL5 open reading frame (ORF), belonging to the RL11 gene family and previously uncharacterized. UL5 is only present in human and chimpanzee cytomegaloviruses while is absent in cytomegaloviruses infecting other species, therefore is considered a ‘private’ gene. Among HCMV strains, UL5 aminoacid sequence is relatively conserved and all minor differences are concentrated in the N-terminus. In silico predictions classify pUL5 as a type Ib membrane protein with no signal peptide and no N-linked glycosylations, while 7 O-glycosylation sites are predicted. Three different mRNAs with similar lengths including UL5 and the previous ORF UL4 have already been described in literature. In order to confirm these data and to exclude the presence of other UL5-containing transcripts, we performed a Northern blot analysis on the total RNA extracted from HCMV-infected cells at different times post infection (p.i.) using an UL5-specific biotinylated DNA probe. A band around 1.5 kb was detected, excluding the presence of further transcripts. To address the study of UL5 protein product (pUL5), a two-step mutagenesis was carried out on a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the entire genome of the TR strain of HCMV to generate a recombinant virus with the addition of an optimized combination of tags (2StrepII-2FLAG) at the C-terminus of pUL5. pUL5 expression profile was studied by immunoblot on lysates of fibroblasts infected with the recombinant pUL5-tagged virus prepared at different times p.i. using an anti-FLAG antibody. Two species of approximately 24 and 15 kDa were detected with late and early expression kinetics, respectively. Since the predicted molecular weight of the entire tagged protein is 24.5 kDa, the higher molecular weight form probably corresponds to the full-length protein. Glycosylation analysis of pUL5 both in transfection and in infection further confirmed the absence of glycosylation events. To investigate the nature of the lower molecular weight species, we performed a PCR site-directed mutagenesis to eliminate a second ATG in UL5 ORF. Western blot analysis on lysates of HEK293T cells transfected with the mutated plasmid of UL5 revealed a strong reduction in the signal of the 15 kDa species. A recombinant form of pUL5 lacking the putative transmembrane region was expressed in E. coli, purified and used to obtain an antiserum in mice. Western blot on lysates of fibroblasts infected with the wild-type virus using the mouse antiserum replicated the previous data, excluding a possible influence of the tags to the obtained results. Confocal microscopy of infected fibroblasts both with wild-type and recombinant viruses, implementing both the pUL5 antiserum and the anti-FLAG antibody, localizes pUL5 with markers of the trans-Golgi network and secretory pathways, in the compartment of viral assembly. Western blot on purified virions failed to reveal the presence of pUL5, suggesting that this protein is only expressed in the host cell during infection but it is not incorporated in the released viral progeny. To have a deeper insight in pUL5 role during infection, an UL5 deletion mutant was generated by BAC mutagenesis and its ability to replicate in human fibroblasts was assessed. The knock-out mutant virus is still able to infect and replicate in fibroblasts but with a strongly reduced replication rate, suggesting an important role of pUL5 during HCMV infection. The recombinant pUL5-tagged virus was also implemented for a pull-down experiment to isolate potential interacting partners using anti-FLAG coupled magnetic beads. Mass spectrometry analysis allowed the identification of the cellular protein IQGAP1 as a pUL5 interactor. IQGAP1 is an ubiquitously expressed cellular protein involved in many cellular mechanisms, such as cytoskeletal remodeling, cell adhesion, cell cycle regulation and Ca2+/Calmodulin signaling, and it is a known target of intracellular pathogens. This interaction was also confirmed by reciprocal immunoprecipitations in transfection, giving new hints on the possible role of pUL5 during HCMV infection.

Il citomegalovirus umano (HCMV) è un virus che infetta la maggioranza degli adulti nel mondo. In pazienti sani, HCMV stimola una forte risposta immunitaria in grado di limitare e contenere il diffondersi dell’infezione, sebbene questo virus sia capace di restare latente nelle cellule infettate e di riattivarsi spontaneamente quando le condizioni sono più favorevoli. La forma acuta dell’infezione da HCMV è associata a particolari condizioni in cui il sistema immunitario è in qualche modo compromesso, ad esempio in pazienti che hanno ricevuto un trapianto d’organo, in pazienti affetti da sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) o in feti che contraggono l’infezione congenita. HCMV possiede il più grande genoma tra gli herpesvirus e, nel tempo, la comunità scientifica sta cercando di esplorare il suo enorme potenziale di espressione. In questo studio ci siamo occupati del prodotto proteico dell’open reading frame (ORF) UL5, appartenente alla famiglia genica RL11 e ancora da caratterizzare. UL5 è presente soltanto nei citomegalovirus di umani e scimpanzé mentre è assente nei citomegalovirus che infettano altre specie e viene pertanto considerato un gene ‘privato’. La sequenza amminoacidica di UL5 è abbastanza conservata tra i diversi ceppi del citomegalovirus umano e tutte le differenze, benché minime, sono concentrate all’N-terminale. Predizioni in silico classificano pUL5 come una proteina di membrana di tipo Ib mancante di un peptide segnale e senza siti di N-glicosilazione, mentre sono predetti 7 siti di O-glicosilazione. In letteratura sono descritti tre mRNA di lunghezza simile contenenti UL5 insieme all’ORF precedente UL4. Per confermare questo ed escludere la presenza di altri trascritti contenenti UL5, abbiamo eseguito un Northern blot sull’RNA totale di cellule infettate da HCMV, estratto a vari tempi dopo l’infezione usando una sonda a DNA specifica per UL5. Il saggio ha evidenziato un’unica banda di circa 1.5 kb, escludendo la presenza di altri trascritti contenenti UL5. Allo scopo di studiare il prodotto proteico di UL5, abbiamo generato un virus ricombinante in cui una serie di tag ottimizzata (2StrepII-2FLAG) è stata aggiunta al C-terminale di pUL5 tramite la mutagenesi a due step di un cromosoma batterico artificiale (BAC) contenente l’intero genoma del ceppo TR di HCMV. Per studiare il profilo di espressione di pUL5 è stato eseguito un immunoblot con un anticorpo anti-FLAG su lisati di fibroblasti infettati con il virus ricombinante, preparati a diversi tempi dopo l’infezione. Il Western blot ha rilevato la presenza di due specie di circa 24 e 15 kDa, espresse con cinetica late e early, rispettivamente. Poiché il peso molecolare atteso della proteina intera compresa di tag è 24.5 kDa, è probabile che questa corrisponda alla banda a peso più alto, suggerendo che non esistano forme glicosilate di pUL5. Per confermare questa teoria abbiamo effettuato un’analisi di deglicosilazione sia in trasfezione che in infezione e non abbiamo rilevato alcuna differenza nell’altezza delle bande corrispondenti a pUL5. Per indagare sulla natura della banda a più basso peso molecolare abbiamo mutato un secondo ATG presente nella sequenza codificante di UL5 che potrebbe corrispondere ad un secondo codone d’inizio della traduzione. Abbiamo poi trasfettato delle cellule HEK293T con il plasmide di UL5 mutata ed eseguito un Western blot sui lisati, rilevando una forte riduzione nel segnale della banda a 15 kDa. Inoltre, abbiamo prodotto in E. coli una forma ricombinante di pUL5 mancante del tratto trans-membrana, l’abbiamo purificata e utilizzata per produrre un antisiero nei topi. Ripetendo gli esperimenti utilizzando il virus wild-type e l’antisiero di topo, abbiamo ottenuto gli stessi risultati, escludendo la possibilità di artefatti dovuti alla presenza dei tag. Esperimenti di microscopia confocale su fibroblasti infettati sia con il virus wild-type che con quello ricombinante e utilizzando sia l’antisiero di topo che l’anticorpo anti-FLAG hanno rilevato pUL5 in co-localizzazione con marcatori del trans-Golgi network e delle vie secretorie, in un compartimento formato tipicamente durante l’infezione da HCMV e deputato all’assemblaggio dei nuovi virus. Allo scopo di verificare se pUL5 viene incorporata nei virioni maturi, abbiamo effettuato un Western blot su virioni purificati e non abbiamo riscontrato la presenza della proteina, che probabilmente viene espressa soltanto durante il ciclo di infezione ma non costituisce una componente strutturale del virus. Per cercare di capire quale possa essere il ruolo di pUL5 durante l’infezione, abbiamo creato un virus ricombinante in cui l’intera ORF di UL5 è stata deleta mediante mutagenesi del BAC e abbiamo valutato la sua capacità di replicazione in fibroblasti umani. Il virus mutante knock-out di UL5 si è rivelato ugualmente in grado di infettare fibroblasti ma con una cinetica di replicazione fortemente ridotta. Infine, abbiamo effettuato un esperimento di pull-down di pUL5 con il fine di identificare eventuali interattori. A questo scopo, abbiamo infettato dei fibroblasti umani con il virus ricombinante taggato e abbiamo immunoprecipitato pUL5 utilizzando delle palline magnetiche rivestite di anticorpo anti-FLAG. L’analisi per spettrometria di massa dell’eluato ha portato all’identificazione della proteina cellulare IQGAP1 come uno degli interattori di pUL5. IQGAP1 è una proteina cellulare espressa in maniera ubiquitaria e coinvolta in molti meccanismi cellulari, tra cui il rimodellamento del citoscheletro, l’adesione cellulare e la regolazione del ciclo cellulare, oltre ad essere un noto bersaglio per i patogeni intracellulari. Questa interazione è stata ulteriormente confermata da immunoprecipitazioni reciproche in trasfezione, dando un ulteriore indizio su quale potrebbe essere il ruolo di pUL5 durante il ciclo di infezione di HCMV.