T7-CYANO - Production and development of a Synechocystis strain useful for inducible membrane protein expression and controlled antisense RNA synthesis

Cyanobacteria are supposed to have been the first organisms able to evolve oxygen by photosynthesis, the process that uses solar light as energy source to fix CO2 into carbohydrate molecules. Historically, they have been and are a model system for studying fundamental processes including and relating to photosynthesis. In more recent years cyanobacteria acquired interest also in biotechnology, in particular as an alternative energy resource, for instance in ethanol or hydrogen production, and as a source for the production of molecules useful in the pharmaceutical industry. Moreover cyanobacteria are interesting host organisms for proteins expression, in particular for membrane proteins. Indeed, the abundant internal membrane system (the thylakoids) typical of cyanobacteria would provide the proper compartment to harbour these kind of proteins, permitting higher production of these proteins. Synechocystis sp. PCC 6803 is nowadays one of the most extensively studied species among all cyanobacteria and is considered a model organism for the study of photosynthesis. Some of the main reason are that it is spontaneously transformable, it can easily incorporate exogenous DNA into its genome by homologous recombination and it is able to grow both photoautotrophically and heterotrophycally. However, the lack of handy episomal elements for cloning and the presence of 10-12 copies of the chromosome per cell have hampered its use so far. The aim of the present study is to develop a Synechocystis strain suitable for a simplified use of DNA recombinant techniques within this organism and for the inducible expression of proteins. The genetic tool consists in a two component system: i) a new Synechocystis strain, called “T7-cyano”, hosting the highly processive RNA polymerase from the bacteriophage T7 under the control of different inducible promoters; ii) vectors, called pSEV (Synechocystis Expression Vectors), for stable introduction of a DNA fragment of interest under the control of the T7 promoter. The system resembles therefore the BL21 strain of Escherichia coli: induction of the T7 RNA polymerase will lead to transcription of the heterologous sequence in a controlled manner. The present work describes the design and the early development of the T7-cyano system. After a brief introduction on cyanobacteria (chapter one), the second chapter describes the design of the new cyanobacterial tool and the construction of a vector, called Transformation Vector, for the stable integration of the T7 RNA polymerase gene in the genome of Synechocystis sp. PCC 6803. In this same chapter, the construction of the second component of the system is also illustrated. This is represented by three different expression vectors having different applications: pSEV1, for Strep-tagged fusion proteins expression; pSEV2, for recombinant expression of endogenous or heterologous proteins; pSAS, for the synthesis of RNA molecules in antisense. The development of the T7-cyano strain is reported in the third chapter. Three different inducible promoters are chosen to control the expression of the T7 RNA polymerase gene: Pzia, a zinc-inducible endogenous promoter, Pnrs, an endogenous nickel-inducible one and variant of the E. coli promoter Plac. By the developed Transformation Vector the T7 RNA polymerase gene is homoplasmically inserted in the genome of the cyanobacterium. The production of the bacteriophage polymerase in the T7-cyano strain is successfully confirmed by immunoblotting upon induction of the Pzia and Pnrs promoters. The system is tested in the expression of three different heterologous proteins (chapter four): the eGFP fluorescence protein; HydA, a [FeFe]-hydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii previously expressed in Synechocystis sp. PCC 6803; and a Baeyer-Villiger monooxygenase, BVMO, from the algae Cyanidioschyzon merolae, previously expressed in Escherichia coli. The sequences of the chosen protein coding genes are cloned in one of the expression vectors developed, pSEV1 and pSEV2, and the obtained vectors are used to transform the T7-cyano strains. In preliminary induction experiments transcript analysis confirms transcription of the heterologous genes by the T7 RNA polymerase. Moreover by western blot, the BVMO enzyme is successfully confirmed expressed in T7-cyano. However the promoters Pzia and Pnrs are found both leaky and the low amount of the BVMO enzyme produced suggests translation inefficiency. In the last chapter the system is proposed for the inducible synthesis of antisense RNAs. Synechocystis sp. PCC 6803, in fact, possesses a significant number of regulatory RNAs transcribed in a wide range of environmental changes and stress conditions. To date, however, only few of them have been characterized and new genetic tools are required for the study and identification of these small RNA molecules. In addition, an interesting application would be the controlled knockdown of endogenous genes. To test the T7-cyano system in the synthesis of antisense RNAs, the characterized IsrR, known to down-regulate the iron-starvation responding gene isiA, is chosen. In addition an antisense is designed against the 5’ UTR of the same isiA gene. The experiments were performed at the Department of Biochemistry of the University of Turku (Finland) at the Molecular Plant Biology group headed by Prof. Eva-Mari Aro, one of the main experts in the study of photosynthetic organisms. Preliminary experiments shows a knockdown phenotype in induced cells, however more experiments are necessary to confirm the silencing of the gene by the synthesis of antisense RNAs in T7-cyano. The present work gives a general view of the new system showing, for the first time, the capability of Synechocystis sp. PCC 6803 to produce the T7 RNA polymerase that in turn is able to transcribe the sequence downstream the T7 promoter. The work also pointed out the two major problematic issues found within the system that are the leakiness of the promoters, Pzia and Pnrs, and a translational inefficiency in proteins expression

Si ritiene che i cianobatteri siano stati i primi organismi in grado di produrre ossigeno attraverso la fotosintesi, il processo chimico che utilizza la luce solare come fonte di energia per fissare la CO2 in molecole di carboidrati. I cianobatteri sono storicamente considerati un sistema modello per lo studio dei processi fotosintetici. Più recentemente questi organismi hanno acquisito un particolare interesse anche in ambito biotecnologico, in particolare come fonte alternativa di energia, per esempio nella produzione di bioetanolo o bioidrogeno, e nella produzione di molecole utili per l'€™industria farmaceutica. I cianobatteri, inoltre, sono interessanti organismi da usare come ospiti per l'espressione di proteine, in particolare per quelle di membrana. Infatti, il loro abbondante sistema membranale interno (i tilacoidi) dovrebbe fornire lo spazio adeguato per la localizzazione di questo tipo di proteine e permettere quindi una maggiore produzione delle stesse. Synechocystis sp. PCC 6803 è a tutt'€™oggi uno dei ceppi cianobatterici più studiati ed è considerato un organismo modello per lo studio della fotosintesi. Le ragioni principali di questo suo ampio utilizzo risiedono in alcune sue caratteristiche: è spontaneamente trasformabile, puù facilmente incorporare DNA esogeno nel suo genoma mediante ricombinazione omologa ed è in grado di crescere sia in fotoautotrofia sia in eterotrofia. Tuttavia, la mancanza di elementi episomali maneggevoli anche per il clonaggio e la presenza di 10-12 copie del genoma per cellula batterica hanno finora ostacolato un suo più vasto sfruttamento. Lo scopo di questo studio è di sviluppare un ceppo di Synechocystis sp. PCC 6803 che semplifichi l'€™utilizzo delle tecniche del DNA ricombinante in questo organismo e che possa essere utilizzato per l'espressione inducibile di proteine. Il tool consiste in un sistema a due componenti: i) un nuovo ceppo di Synechocystis sp. PCC 6803, chiamato "T7-cyano", che ospita il gene codificante la T7 RNA polimerasi sotto il controllo di diversi promotori inducibili; ii) un set di vettori, chiamati pSEV (Synechocystis Expression Vectors), per l'introduzione stabile nel genoma di un frammento di DNA di interesse sotto il controllo del promotore T7. Il sistema è analogo al ceppo BL21 di Escherichia coli: l'€™induzione della T7 RNA polimerasi conduce alla trascrizione della sequenza eterologa in modo controllato. Il presente lavoro descrive il disegno sperimentale del sistema T7-cyano e i risultati preliminari conseguenti alla sua induzione. Dopo una breve introduzione sui cianobatteri (capitolo uno), nel secondo capitolo è descritto il nuovo tool cianobatterico e la costruzione di un vettore, Transformation Vector, per l'integrazione stabile del gene codificante la T7 RNA polimerasi nel genoma di Synechocystis. In questo stesso capitolo, è inoltre illustrata la costruzione della seconda componente del sistema. Questa è rappresentata da tre diversi vettori di espressione aventi diverse applicazioni: pSEV1, per l'espressione di proteine in fusione con uno Strep-tag; pSEV2, per l'espressione di proteine ricombinanti endogene o eterologhe; pSAS, per la sintesi di molecole di RNA in antisenso. La creazione e lo sviluppo del ceppo T7-cyano è riportata nel terzo capitolo. Tre diversi promotori inducibili sono selezionati per controllare l'espressione della T7 RNA polimerasi. I promotori scelti sono: Pzia, un promotore endogeno inducibile dallo zinco, Pnrs, un altro promotore endogeno inducibile da nickel e una variante del promotore Plac di Escherichia coli. Utilizzando il Transformation Vector il gene della T7 RNA polimerasi è inserito in omoplasmia nel genoma del cianobatterio. La produzione della T7 RNA polimerasi è, per la prima volta in Synechocystis, mostrata mediante analisi di immunoblotting nei ceppi con i promotori Pzia e Pnrs. Il sistema è quindi testato nell'espressione di tre differenti proteine eterologhe (capitolo quattro): la proteina fluorescente eGFP; HydA, una [FeFe]-idrogenasi proveniente dall'alga Chlamydomonas reinhardtii precedentemente espressa in Synechocystis sp. PCC 6803; e una Baeyer-Villiger monoossigenasi (BVMO) dell'alga Cyanidioschyzon merolae, già precedentemente espressa in Escherichia coli. Le sequenze codificanti le tre proteine prescelte sono clonate in uno dei vettori di espressione sviluppati, pSEV1 e pSEV2, e i vettori ottenuti sono utilizzati per trasformare i ceppi di T7-cyano. In esperimenti preliminari di induzione è confermata la trascrizione dei geni eterologhi ad opera della T7 RNA polimerasi. Inoltre attraverso immunoblotting è stata con successo rilevata l'espressione dell'enzima BVMO. Tuttavia i promotori Pzia e Pnrs, sia mediante l'analisi dei trascritti che immunoblotting, sono risultati leaky. Inoltre la bassa quantità dell'enzima BVMO prodotta suggerisce una inefficiente traduzione del gene esogeno. Nell'ultimo capitolo il sistema T7-cyano è proposto per la sintesi inducibile di RNA antisenso. Synechocystis sp. PCC 6803, infatti, possiede un numero elevato di piccoli RNA regolatori trascritti in diverse condizioni ambientali e di stress, tuttavia solo pochi RNA antisenso sono stati caratterizzati tutt'oggi. Il nuovo sistema puù quindi essere un utile tool per lo studio e la caratterizzazione di queste piccoli RNA. Inoltre una interessante applicazione sarebbe il knockdown controllato di geni endogeni. Per testare il sistema T7-cyano nella sintesi di RNA antisenso, viene scelto IsrR, uno dei pochi RNA antisenso già caratterizzato in Synechocystis sp. PCC 6803, noto down-regolatore del gene IsiA attivato in condizioni di carenza di ferro. In aggiunta è disegnato un secondo RNA antisenso contro il 5'UTR dello stesso gene IsiA. Gli esperimenti preliminari di induzione sono stati svolti presso il dipartimento di biochimica della University of Turku (Finland) nel gruppo di ricerca Molecular Plant Biology guidato dalla Prof. Eva-Mari Aro, esperta nello studio degli organismi fotosintetici. I primi risultati mostrano un fenotipo knockdown nei ceppi indotti, tuttavia maggiori esperimenti sono necessari per confermare il silenziamento del gene attraverso la sintesi di antisenso nei T7-cyano. Il lavoro di questa tesi fornisce una visione di insieme del nuovo sistema mostrando, per la prima volta, la capacità di Synechocystis sp. PCC 6803 di produrre la T7 RNA polimerasi che a sua volta è in grado di trascrivere il gene clonato a valle del promotore T7. Il lavoro ha inoltre evidenziato le due maggiori problematiche del sistema ovvero la leakiness dei promotori Pzia e Pnrs e una inefficiente traduzione del gene eterologo