Effects of p66shc expression on bioenergetics and cell viability of b-cell chronic lymphocytic leukemia

During tumorigenesis many oncogenic pathways are reprogrammed and modulate mitochondrial metabolism, decreasing oxidative phosphorylation (OXPHOS) activity. They inhibit ATP synthesis and ROS production from OXPHOS complexes favoring metabolic switching toward a more glycolytic metabolism and tumor growth. This metabolic rewiring is well established in solid tumor but very little is known about this event in non-solid tumors such as leukemias. Indeed, it has been demonstrated that in chronic lymphocytic leukemia (B-CLL), cells show a high OXPHOS activity and elevated ROS levels. Notably, expression of the p66Shc protein, whose mitochondrial fraction modulates cell bioenergetics and increases ROS generation, is lost during B-CLL tumorigenesis. I investigate the effects of the expression of p66Shc on bioenergetics and viability of B-CLL cells. After p66Shc expression in MEC-1 cells, a B-CLL cell model, a fraction of it is in the intermembrane space of mitochondria. p66Shc expression decreases both basal and maximal respiration, decreases mitochondrial membrane potential, total ATP levels and renders cells less dependent from OXPHOS to ATP supply without changes mitochondrial mass. I propose that decreased mitochondrial respiration is due to decreased activity of respiratory complex I and II. In more detail, there is a decrease in complex I assembly with a consequent inhibition of its activity, and a decrease in complex II activity caused by a multi-protein complex in which TRAP1 and active ERK are involved. p66Shc expression in MEC-1 cells increases mitochondrial ERK activation. The mitochondrial fraction of ERK contribute to tumor cell survival by inhibiting opening of the permeability transition pore (PTP), a mitochondrial channel whose opening irreversibly commits cells to death. I check the effect of p66Shc expression on cell viability. Although its pro-apoptotic function well described in many cell models, in MEC-1 cells p66shc protects cells from death induced by mitochondrial-derived oxidative stress derived from starvation, EM20-25 and CisPlatin treatments. In depletion conditions, p66Shc expression correlates with more active mitochondrial ERK and the inhibition of ERK decreases cell viability. Inhibition of mitochondrial chaperones activity with Cyclosporine A, an inhibitor of CyP-D, or 17AAG, an inhibitor of TRAP1, also affects cell viability under depletion condition, thus supporting the hypothesis that mitochondrial ERK is involved in survival mechanism induced by p66Shc expression. Taken together these data indicate that regulation of RC complex activity can be linked to regulation of cell survival. We hypothesize that the mitochondrial branch of the Ras-ERK signaling pathway regulates mitochondrial bioenergetics by affecting SDH activity and resistance to apoptosis of B-CLL cells. Through the activation of mitochondrial ERK and inhibition of SDH activity, p66Shc can decrease OXPHOS activity and ROS production, a condition that is necessary in the early stages of tumorigenesis. It can also support tumour cell growth making mPTP less sensitive to opening by activating mitochondrial ERK.

Durante lo sviluppo tumorale, molte vie di segnale delle cellule vengono riprogrammate cambiando il metabolismo mitocondriale e diminuendo l’attività della fosforilazione ossidativa. In questa maniera viene diminuita la produzione di ATP e di ROS da parte della fosforilazione ossidativa favorendo un metabolismo glicolitico e la crescita tumorale. I meccanismi alla base dello sviluppo di questo fenotipo sono ben caratterizzati nelle cellule di tumori solidi, ma poco si sa a riguardo delle leucemie. Nella leucemia linfocitica cronica, le cellule presentano elevata attività OXPHOS e alti livelli di ROS. È noto che la proteina p66Shc, di cui una frazione si trova nello spazio intermembrana del mitocondrio, modula la bioenergetica cellulare e induce la produzione di ROS. Durante il processo di tumorigenesi della B-CLL l’espressione di p66Shc viene persa. Quindi, sono andata ad analizzare l’effetto della espressione di p66Shc sulla bioenergetica e la vitalità cellulare della leucemia linfocitica cronica. Dopo l’espressione di p66Shc nel modello cellulare di leucemia linfocitica cronica di tipo B, MEC-1, una frazione della proteina è stata trovata nello spazio intermembrana dei mitocondri. L’espressione di p66Shc nelle cellule diminuisce la respirazione mitocondriale, massima e basale, ma anche il potenziale di membrana e i livelli totali di ATP. Ho proposto che queste differenze sono dovute alla diminuzione dell’attività dei complessi respiratori: complesso I e complesso II indotta dalla espressione di p66Shc nelle cellule MEC-1. In particolare, il complesso I è meno assemblato con la conseguente diminuzione della sua attività mentre il complesso II diminuisce la sua attività a causa di un complesso multi proteico in cui sono coinvolti la proteina chinasi ERK e lo sciaperone mitocondriale TRAP1. L’espressione di p66Shc nelle MEC-1 aumenta l’attivazione della frazione mitocondriale di ERK. Questa frazione, contribuisce alla sopravvivenza delle cellule tumorali inibendo l’apertura del poro di transizione di permeabilità (mPTP), un canale mitocondriale la cui apertura porta alla morte cellulare. Ho quindi analizzato l’effetto dell’espressione di p66Shc sulla vitalità cellulare delle MEC-1. Sebbene, p66Shc ha una attività pro-apoptotica, ho osservato che la sua espressione nelle MEC-1 protegge le cellule dalla morte cellulare indotta dallo stress ossidativo prodotto dal mitocondrio da trattamenti come EM20-25, CisPlatino e assenza di glucosio. In assenza di glucosio, l’espressione di p66Shc correla con una maggiore attivazione di ERK nel mitocondrio. L’inibizione di ERK diminuisce la vitalità cellulare. In assenza di glucosio, anche l’inibizione degli sciaperoni mitocondriali CyP-D e TRAP1 influenzano la vitalità cellulare. Quindi, la frazione mitocondriale di ERK è coinvolta nella regolazione delle vie di segnale che proteggono le cellule dalla morte cellulare dopo l’espressione di p66SHhc. Questi dati, indicano che la regolazione dell’attività dei complessi respiratori è legata alla regolazione della sopravvivenza cellulare. Abbiamo ipotizzato che nella leucemia linfocitica cronica la parte mitocondriale della via di segnale RAS-ERK può regolare la bioenergetica influenzando l’attività enzimatica del complesso II e la resistenza alla morte cellulare. Inoltre, abbiamo ipotizzato anche una nuova funzione per p66Shc in cui, attraverso l’attivazione di ERK e l’inibizione dell’attività del complesso II può diminuire l’attività della fosforilazione ossidativa e i livelli di ROS, una condizione necessaria nelle prime fasi della tumori genesi. p66Shc può anche sostenere la crescita tumorale rendendo mPTP meno sensibile all’apertura attraverso l’attivazione della frazione mitochondrial di ERK.