Design, synthesis and biochemical evaluation of novel CK2 and CDK2 inhibitors

Kinases are a class of enzymes, which catalyse the transfer of the terminal phosphate of a molecule of ATP, or more rarely of GTP, to a protein that acts as a substrate. This process is reversible and is maintained by the presence of other enzymes, namely the phosphatases, which catalyse the reverse reaction. An imbalance between these enzymes plays a crucial role in the occurrence of diseases, which is attributable to abnormal levels of phosphorylation. The aim of this research was the design and synthesis of novel potent and selective benzimidazole-based inhibitors of Casein Kinase 2 (CK2) and the design and synthesis of pyrimidine-based inhibitors of Cyclin-dependent Kinase 2 (CDK2). This research was carried out at the University of Padua in collaboration with Newcastle University. CK2 is a ubiquitous, highly pleiotropic Ser/Thr protein kinase, which has been implicated in every stage of cell cycle progression. DRB was the first CK2 ATP-mimetic inhibitor identified (IC50 = 23 μM) and was also the starting point for a new fruitful class of polyhalogenated benzimidazole-based compounds. The synthesis of CK2 bifunctional inhibitors, which could simultaneously interact with the ATP pocket and the substrate-binding domain, was proposed. A polyhalogenated benzimidazole scaffold was used as starting point and was then coupled to different peptidic chains. CDK2, belongs to a family of Ser/Thr kinases. In complex with regulatory subunits, cyclin E or A, CDK2 is involved in driving the cell cycle. The overexpression of CDK2 and the deregulation of cyclins associated with CDK2 are often observed in cancer. NU6300 (2), a purine-based CDK2 inhibitor (IC50 = 63 nM), can be considered the first CDK2 irreversible inhibitor due to a covalent interaction between the vinyl sulfone moiety and Lys89 within the ATP-binding domain of CDK2. Structure-activity relationship (SAR) studies on the O6-alkylguanine series revealed that the purine pharmacophore is not a prerequisite for CDK2-inhibitory activity. Hence, a series of pyrimidine-based CDK2 inhibitors was synthesised. Structural modifications at the pyrimidine scaffold were then considered in order to investigate the binding affinity, potency and selectivity of the novel CDK2 inhibitors. All new compounds were evaluated for CK2- and CDK2-inhibitory activity, with promising inhibitors being subjected to more comprehensive biological studies. Concerning CDK2 inhibitors, docking and co-crystallisation studies were also performed in order to rationalise the results and propose new compounds to be synthesised

Le chinasi sono una classe di enzimi in grado di catalizzare il trasferimento di un gruppo fosfato terminale di una molecola di ATP, o più raramente di GTP, ad una proteina che agisce da substrato. Questo processo è reversibile, ed è mantenuto tale dalla presenza di altri enzimi, le fosfatasi, che catalizzano la reazione inversa. Uno squilibrio tra questi enzimi gioca un ruolo rilevante nell’incidenza di diverse patologie, le quali sono attribuibili ad elevati livelli di fosforilazione. Questo lavoro di ricerca ha avuto lo scopo di progettare e sviluppare nuovi potenti e selettivi inibitori di casein chinasi 2 (CK2) a struttura benzimidazolica, e progettare e sviluppare nuovi inibitori a struttura pirimidinica di chinasi ciclina dipendente 2 (CDK2). La ricerca è stata svolta presso l’Università degli Studi di Padova (IT) in collaborazione con l’Università di Newcastle (UK). CK2 è una Ser/Thr chinasi ubiquitaria, altamente pleiotropica e coinvolta in ogni fase della progressione del ciclo cellulare. DRB è stato il primo inibitore di CK2 ATP-mimetico ad essere identificato (IC50 = 23 μM), e anche punto di partenza per la sintesi di una nuova classe di inibitori poli-alogenati a struttura benzimidazolica. E’ stata proposta la sintesi di inibitori bifunzionali di CK2, i quali si pensa vadano ad interagire simultaneamente con la tasca catalitica dell’ATP e con il sito di legame del substrato. Come punto di partenza è stato scelto uno scaffold benzimidazolico poli-alogenato, il quale è stato poi legato ad una serie di sequenze peptidiche. CDK2 appartiene anch’essa ad una famiglia di chinasi Ser/Thr-dipendenti. CDK2, complessandosi con subunità regolatorie (ciclina A o E), è coinvolta nella progressione del ciclo cellulare. Una caratteristica ricorrente nei tumori sono la sovraespressione di CDK2 e la deregolazione delle cicline ad essa associate. NU6300, un inibitore a scaffold purinico di CDK2 (IC50 = 63 nM), è considerato il primo inibitore di CDK2 irreversibile, questo grazie all’interazione covalente tra il gruppo vinilsulfonico e un residuo di lisina (Lys89), presente all’interno della tasca catalitica dell’enzima CDK2. Studi di relazione struttura-attività (SAR) riguardanti una serie di O6-alchilguanine hanno rivelato che il farmacoforo di tipo purinico non è un requisito essenziale per l’attività inibitoria su CDK2. Per questo è stata sviluppata una serie di inibitori CDK2 di tipo pirimidinico. Sono state quindi considerate alcune modifiche strutturali allo scaffold pirimidinico, in modo da esaminare l’affinità di binding, la potenza e la selettività dei nuovi inibitori di CDK2. I nuovi inibitori sono stati valutati per la loro attività inibitoria su CK2 e CDK2 rispettivamente. Gli inibitori più promettenti sono stati poi sottoposti ad ulteriori studi biologici. Per quanto riguarda gli inibitori di CDK2 sono stati effettuati studi di docking molecolare e di co-cristallizzazione per razionalizzare i risultati ottenuti e pianificare nuove vie di sintesi