Use of microparticulated whey protein (MWP) in the Italian dairy industry

The thesis is composed of four contributes, dealing with different approaches developed to understand the different aspects of whey proteins (WP) recovery, and their use across cheese manufacturing. The general aim of the research project was to investigate and propose strategies for the utilization of whey and whey products in cheese produced by an Italian dairy industry. The Soligo dairy cooperative (Soligo, Treviso, Italy) was partner and supported the project. In this scenario, the objectives of the first contributes was to develop a gold-method for WP quantification in whey, by Reversed Phase -HPLC, and to evaluate the potential of mid infrared spectroscopy (MIRS) in WP prediction. Whey proteins included α-Lactoalbumin (α-LA), β-Lactoglobulin A and B (β-LG), bovine serum albumin, caseinomacropeptides, proteose peptone and total WP identified. Repeatability and reproducibility tests, in validation procedures, were performing by calculating the relative standard deviation (RSD) within and across days for retention times and peak areas. Samples of whey (n = 187) were analysed according to the reference methods and MIRS spectra were stored (900 - 4000 cm-1); statistical analysis was carried out through partial least squares regression and random cross-validation procedure. Retention times were stable, with RSD ranging between 0.03% and 0.80%. The RSD of peak area in repeatability and reproducibility tests ranged from 0.25% to 8.48% depending on the considered proteins and their relative abundance; indeed, better coefficients of determination in validation were obtained for fractions present in whey in large amounts, as β-LG (0.58), total identified WP (0.58), α-LA (0.56), while minor WP were predicted with minor appreciable accuracy. Results from this study propose a high-throughput and high-resolution method for WP quantification in whey and show the potential of MIRS for their prediction. The objective of the second contribute was to investigate the effect of increasing concentrations of microparticulated whey proteins (MWP; from 0.0 to 9.0%, vol/vol) on milk coagulation properties (MCP), namely rennet coagulation time (RCT), curd-firming time, and curd firmness 30 min after rennet addition (a30). Three bulk milk samples, collected and analyzed during 3 days, were added with 6 concentrations of MWP (vol/vol): 1.5%, 3.0%, 4.5%, 6.0%, 7.5%, and 9.0%. Moreover, a sample without MWP was used as control. Milk coagulation properties were measured using Formagraph (Foss Electric A/S, Hillerød, Denmark). The increment of the amount of MWP added to milk led to longer RCT. In particular, significant differences were found between RCT of the control samples (13.5 min) and RCT of samples added with 3.0% (14.6 min) or more of MWP. Similar trend was observed for curd-firming time, which showed the shortest time in the control samples and the longest in samples with 9.0% (21.4 min) of MWP. No significant differences were detected for a30 across concentrations of MWP. Adjustments in cheese processing should be made when recycling MWP, in particular during coagulation process by prolonging the time of rennet activity before cutting of the curd. Aim of the third study was to evaluate the effect of MWP, using standardized milk with different protein-to-fat ratios (PFR; high, standard and low levels of fat) and increasing MWP concentrations (from 0.0 to 4.0 %, vol/vol) on milk coagulation process, cheese yield and composition of 30 cheese samples carried out through a mini cheese-making technique. The increment of PFR affected RCT. Moreover, cheese yield decreased as the level of fat decreased, and it was higher in low-fat cheese (high PFR) with 4.0% MWP compared with low-fat cheese with 3.0% MWP. No differences were found for cheese yield in standard and high fat cheese (standard and low PFR) across MWP concentrations. The stable composition of low-fat Caciotta suggests the possibility to include MWP as fat replacer to maintain the yield. The fourth contribute aimed at the investigating the effectiveness of Hyper Spectral Image (HSI) technique to detect MWP in low-fat Caciotta cheese, produced with increased concentration of MWP (2.0%, 3.0%, 4.0% vol/vol). Hyperspectral image is an emerging technology successfully employed in food inspection, by combining the advantages of conventional digital image and spectroscopy to obtain both spatial and spectral information from an object. Twelve mini-cheese making were performed using standardized milk in low fat condition (3.5% of protein and fat). Protein levels were adjusted with 2.0%, 3.0% or 4.0% MWP vol/vol. For each day of cheese making a control thesis without MWP was performed (0.0% MWP). After one month of ripening a slice of each cheese was analysed for the acquisition of near infrared image in range wavelengths from 1,100 to 1,600 nm, for a total of 140 wavelengths measured. Several spatial and spectral pre-processing were tested: two times spatial binning, and standard normal variate plus second derivate were select as optimal. Principal component analysis reported an explained variability of 7% across treatments. Cluster analysis evidenced an increment in component presence by increasing MWP percentage in treatments. Moreover, a score plot reported a destine classification of samples contains MWP and control without. The results confirm the ability of HIS in MWP detection, and this information can be used to construct further classification models able to discriminate cheese adulteration for MWP addition.

L’obiettivo generale di questa tesi di dottorato, composta da quattro contributi sperimentali, è stato la valorizzazione del siero derivante dalla caseificazione e l’utilizzo delle sieroproteine (WP) nel processo di caseificazione di formaggi freschi. Il caseificio di Soligo (Soligo, Treviso, Italy) è stato partner del progetto e ha supportato le attività sperimentali fornendo tutte le materie prime. In questo scenario, l’obiettivo del primo contributo è stato lo sviluppo di un metodo HPLC a fase inversa (RP - HPLC) per la quantificazione di WP, e la possibilità di poter utilizzare tale metodo come riferimento per la predizione di WP utilizzando la spettroscopia del medio infrarosso (MIRS). Le WP predette sono state: α-Lattoalbumina (α-LA), β-Lattoglobulina A and B (β-LG), albumina di siero bovino, caseinomacropeptides, proteoso peptone e WP totali identificate. I test di ripetibilità e riproducibilità, per la validazione del metodo RP-HPLC, sono stati calcolati come deviazione standard relativa (RSD) entro e tra giorni, per il tempo di ritenzione e l’area dei picchi. Per lo sviluppo dei modelli di calibrazione MIRS i campioni di siero (n = 187) sono stati analizzati con il metodo di riferimento (HPLC) e sono stati archiviati gli spettri MIRS (900 - 4000 cm-1); le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando le partial least square regression e una procedura di validazione interna random. Il tempo di ritenzione è risultato stabile, con RSD tra 0.03% e 0.80%. Mentre, l’area variava da 0.25% a 8.48%, in modo dipendente dalle concentrazioni delle WP. Inoltre, i migliori coefficienti di determinazione dei modelli di predizione MIRS sono stati evidenziati per le WP presenti in elevate quantità, come le β-LG (0.58), WP totali (0.58), e α-LA (0.56). I risultati di questo primo studio hanno evidenziato un metodo RP-HPLC ad alta risoluzione e che potrà essere utilizzato come metodo di riferimento per lo sviluppo di modelli di predizione MIRS. L’obiettivo del secondo contributo sperimentale è stato la valutazione dell’aggiunta di microparticolato di siero proteine (MWP; da 0.0 a 9.0%, vol/vol) sulle proprietà di coagulazione del latte (MCP), conosciute come tempo di coagulazione (RCT), tempo di rassodamento, e consistenza del coagulo dopo 30 minuti dall’aggiunta del caglio (a30). Tre campioni di latte di massa sono stati analizzati in tre giorni; entro giornata, le aliquote di latte sono state addizionate con concentrazioni crescenti di MWP (vol/vol): 1.5%, 3.0%, 4.5%, 6.0%, 7.5%, and 9.0%. Inoltre, è stato preparato un doppio controllo senza MWP. Le proprietà di coagulazione sono state misurate con lo strumento Formagraph (Foss Electric A/S, Hillerød, Denmark). L’aumento di concentrazione di MWP ha portato ad un prolungamento di RCT. In particolare, differenze significative sono state ottenute tra il controllo (13.5 min) e RCT nei campioni con 3.0% (14.6 min) o più di MWP. Un andamento simile è stato ottenuto per il tempo di rassodamento. Nessun effetto è stato osservato per a30 tra le concentrazioni di MWP. I risultati hanno dimostrato che l’utilizzo di MWP durante la coagulazione del latte richiede un prolungamento della fase di coagulazione prima del taglio della cagliata. Il terzo contributo mirava alla valutazione dell’effetto dell’aggiunta di MWP (da 0.0 a 4.0%, vol/vol), utilizzando latte standardizzato con diversi rapporti proteina-grasso (PFR: elevato, standard e basso livello di grasso) sul tempo di coagulazione, composizione e resa del formaggio. Trenta campioni di formaggio sono stati ottenuti attraverso una tecnica di mini caseificazione. L’aumento di PFR ha influenzato il tempo di coagulazione. La resa di caseificazione è diminuita al diminuire dei livelli di grasso, ed è risultata più elevata quando sono stati utilizzati livelli del 4% di MWP nei formaggi a basso contenuto di grasso. Mentre, non è stata evidenziata nessuna differenza nella resa di caseificazione nel formaggio prodotto in condizioni standard e ad elevato contenuto di grasso considerando le diverse concentrazioni di MWP usato. È, inoltre, risultata stabile la composizione chimica dei formaggi magri, questo suggerisce la possibilità di includere MWP come sostituto del grasso per mantenere composizione e resa. L’obiettivo dell’ultimo contributo sperimentale è stato la valutazione dell’utilizzo dell’analisi d’immagine iperspettrale (HSI) per la rivelazione dell’aggiunta di MWP (da 2.0% a 4.0%, vol/vol) in prodotti caseari a basso contenuto di grasso. L’analisi d’immagine iperspettrale è una tecnica relativamente recente applicata con successo nell’indagine di composizione degli alimenti; HSI, infatti, combina la tradizionale analisi d’immagine con le informazioni spettrali dell’oggetto analizzato. Dodici campioni di formaggio sono stati ottenuti con una tecnica di mini caseificazione, e prodotti utilizzando latte magro (3.5% grasso) mentre i livelli proteici (3.5%) sono stati aggiustati con concentrazioni crescenti di MWP (da 2.0% a 4.0% vol/vol). Inoltre è stato effettuato un controllo senza MWP (0.0% MWP). Dopo un mese di stagionatura i campioni sono stati analizzati archiviando le lunghezze d’onda da 1,100 a 1,600 nm, per un totale di 140 valori misurati. Le informazioni spettrali sono state trattate statisticamente attraverso le standard normal variate e derivata seconda prima dell’analisi PCA. L’analisi delle componenti principali ha riportato una variabilità spiegata del 7% tra i trattamenti con MWP ed il controllo. Lo score plot ha mostrato una diversa classificazione dei campioni contenenti MWP rispetto ai campioni di controllo senza l’aggiunta di MWP. Questi risultati confermano la possibilità di utilizzare la tecnologia HSI per la rilevazione di MWP nei prodotti lattiero caseari, e possono essere utilizzati per lo sviluppo di modelli di predizione capaci di discriminare i prodotti nei quali è avvenuta l’aggiunta di MWP.