STUDIES OF Ca2+ DYNAMICS IN INTRACELLULAR COMPARTMENTS IN PLANTS: ADVANCED MOLECULAR TOOLS FOR IN VIVO IMAGING

Plants react to environmental challenges through immediate signal-transduction pathways. Free calcium ions (Ca2+) are one integral component of many transduction pathways, in both plant and animal cells. A wide variety of signals including biotic, abiotic, and developmental stimuli evokes specific spatio-temporal Ca2+-transients, which are further transduced by Ca2+ sensor proteins into transcriptional and metabolic responses. Most of the research on Ca2+ signalling in plants has been focused on transport mechanisms of Ca2+ into and out of the cytoplasm as well as on the components involved in decoding cytoplasmic Ca2+ signals, which have been extensively reviewed (Kudla et al. 2010,Dodd et al. 2010). Recent advances report that the different organelles are involved in Ca2+ signaling and their role in stress perception has been highlighted (Stael et al. 2012,Nomura and Shiina. 2014,Xiao et al. 2013). The aim of this PhD project was to elucidate the involvement of subcellular compartments (e.g. mitochondria, endoplasmic reticulum (ER) and chloroplasts/plastids) in shaping the Ca2+ signature triggered in plant cells by different stimuli. To pursue our aims, we developed a series of molecular tools that enabled subcellular Ca2+ analyses, thus we analyzed Ca2+-dynamics in complex plant tissues (e.g. roots) as well as in single cells. These tools, together with both genetic and pharmacological approaches, will be instrumental to understand the role of organelles in Ca2+ homeostasis. Several FRET-based genetically-encoded probes with different Ca2+ affinities, called Cameleons, have been developed and allow to measure Ca2+ dynamics in vivo (Miyawaki et al. 1999,Palmer and Tsien. 2006). In the present study, we first developed a series of constructs for targeting Cameleon probes to different plant cell organelles (mitochondria, ER and chloroplast/plastids). Then, the constructs were introduced in Arabidopsis thaliana plants for the generation of stable transgenic lines. Whereas the mitochondrial and the ER Cameleon probes were efficiently expressed in wild type A. thaliana plants, the constitutive expression of the plastidial probe was affected by post transcriptional gene silencing. We bypassed this issue by introducing the chloroplastic/plastidial probe in the A. thaliana rdr6 silenced suppressed mutant (Peragine et al. 2004), obtaining the constitutive expression of the probe. First, we analyzed mitochondrial Ca2+ dynamics using the D3cpV and the YC3.6 Cameleon probes (Kd 600nM and Kd 250nM respectively) targeted to the mitochondrial matrix. The analyses performed using these two mitochondrial lines (4mt-YC3.6 and 4mt-D3cpv) revealed that although both probes are able to measure Ca2+-dynamics in this organelle, the YC3.6 Cameleon offers a better sensitivity, showing a higher dynamic range. Moreover, the comparison of Ca2+-dynamics monitored with the two probes suggests that measurements performed with the YC3.6 probe are unaffected by endogenous mitochondrial CaMs as well as D-family probes. The analyses performed with the 4mt-YC3.6 line showed that mitochondria are able to respond, in terms of Ca2+-transient, to several stimuli that cause Ca2+-transient in the cytosol, like osmotic stress in the guard cells and eATP in the root. Our results suggest that mitochondrial Ca2+-accumulation is strictly dependent on cytosolic [Ca2+] increase. Then, we focused our analysis on the ER, targeting the D1 (Kd1 0.8 and Kd2 60M) and the D4 (Kd 195M) Cameleon probes to the ER lumen. Although, D1 was previously used to study ER Ca2+-dynamics in mammalian cells (Palmer et al. 2004), in our analyses performed with on CRT-D1ER seedlings roots, this probe was not able to report any [Ca2+] changes. On the contrary, the D4 (CRT-D4ER) probe proved to be suitable for monitoring ER Ca2+-dynamics and the ER Ca2+-status ([Ca2+]ER). By means of this transgenic line, we evaluated by a pharmacological approach the contribution of two Ca2+-ATPase classes (ECA and ACA) in the maintenance of ER Ca2+ homeostasis. Our results revealed that ECA pumps have a fundamental role in Ca2+-accumulation in the ER, since their inhibition lead to a decrease in the [Ca2+]ER. Furthermore, we analyzed Ca2+-dynamics in the ER under several stimuli known to induce cytosolic Ca2+-transients, such as glutamate, eATP, NaCl, and the alternate imposition of depolarizing and hyperpolarizing buffers. Our experiments showed that plant ER responds to all these stimuli showing Ca2+-accumulation, suggesting a different role for the ER in plants than in mammalian cells. In fact, in our experiments the ER behaves as a capacitor of cytosolic Ca2+ instead of as a primary source of Ca2+ in the generation of the cytosolic Ca2+-transients. At the end, we moved our attention to chloroplastic and plastidial Ca2+-dynamics using two probes, to extend the range of measurable stromal Ca2+ concentrations ([Ca2+]str). We chose the YC3.6 probe (2Bam4-YC3.6) since the reported [Ca2+]str is approximately hundreds of nano molar, similar to the cytosol (Nomura et al. 2012), and the probe YC4.6 (2Bam4-YC4.6), which has an in vitro biphasic Ca2+-dependency (Kd 56nM and 14M) and that should enable to image both subtle and large changes in [Ca2+]str. Then, we analyzed plastidial Ca2+-dynamics in response to several concentrations of eATP in the root tip. We observed that different concentrations evoked dose-dependent Ca2+ responses in plastids (both in 2Bam4-YC3.6 and in 2Bam4-YC4.6 lines) and in the cytosol, suggesting a correlation between Ca2+-dynamics in these two compartments. Furthermore, we analyzed Ca2+-dynamics in chloroplasts of the guard cell, during the light to dark transition. We identified two distinct components of the Ca2+-uptake triggered by this stimulus: a previously described sustained Ca2+-transient (Nomura et al. 2012,Sai and Johnson. 2002) and autonomous Ca2+-oscillations. Moreover, our analyses suggest that the two events have different Ca2+-sources, the sustained Ca2+-transient is dependent on an intra-chloroplast Ca2+-store, that might be the thylakoids lumen, while the oscillations are generated by an intracellular source, likely the cytosol. At the end, we performed experiments on entire leaf during wounding stress, by monitoring both cytosolic and chloroplastic Ca2+-dynamics. In the cells surrounding the damaged area, wounding induced a strong cytosolic Ca2+-transient and concomitantly a rapid stromal Ca2+-transient, suggesting that chloroplastic Ca2+ would contribute to the wounding-induced cellular response. Summarizing we characterized the Ca2+-dynamics in intracellular compartments in complex tissue like the root tip during the eATP treatment. Our analysis revealed that mitochondria, ER and plastids are able to accumulate Ca2+ in response to this stimulus and participate in the Ca2+ sequestration from the cytosol. These data suggest that, in response to eATP, the vacuole might represent the intracellular Ca2+-store involved in the generation of the cytosolic Ca2+ transient. We also characterized Ca2+-dynamics of mitochondria and chloroplasts at single cell level, studying the model system guard cell during the light to dark transition. Our experiments revealed that only chloroplasts are sensible to this stimulus, mitochondria, in fact, showed no Ca2+-transients. In conclusion, we report the development of a series of new molecular tools for the analyses of Ca2+-dynamics in different plant organelles that will be useful for future researches aimed at identifying the role of organellar Ca2+ in the response to environmental and developmental stimuli.

Le piante reagiscono a diversi stimoli ambientali attivando vie di trasduzione del segnale in cui il calcio (Ca2+) svolge un ruolo centrale come componente del signalling intracellulare. Una grande varietà di stimoli biotici, abiotici o di sviluppo causano specifici transienti di Ca2+, i quali sono successivamente tradotti in risposte trascrizionali e metaboliche. La maggior parte delle ricerche sul Ca2+ come secondo messaggero è focalizzata sullo studio delle proteine coinvolte nella codifica di questo segnale e sui meccanismi di trasporto di questo ione attraverso le membrane (Kudla et al. 2010,Dodd et al. 2010). Recenti scoperte riportano che differenti organelli sono coinvolti nelle vie di segnale controllate dal Ca2+ ed, inoltre, sottolineano il loro ruolo nella percezione degli stress ambientali (Stael et al. 2012,Nomura and Shiina. 2014,Xiao et al. 2013). Questo progetto di dottorato ha lo scopo di studiare il coinvolgimento dei diversi compartimenti sub-cellulari (quali mitocondri, reticolo endoplasmatico e plastidi/cloroplasti) nella formazione del transiente di Ca2+ generato dalle cellule vegetali in risposta a differenti stimoli. Per raggiungere questo obiettivo è stata sviluppata una serie di strumenti molecolari che permettano l’analisi in vivo a livello sub-cellulare del Ca2+ in tessuti vegetali complessi (come la radice) e a livello di singola cellula (come la cellula di guardia). Questi strumenti, combinati con approcci genetici e farmacologici, saranno indispensabili per capire in modo più approfondito il ruolo dei diversi organelli nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+. Oggigiorno, sono disponibili diverse sonde geneticamente codificate basate sul fenomeno della FRET (trasferimento di energia di Föster), chiamate Cameleon, che presentano diverse affinità per lo ione Ca2+ e permettono di monitorare in vivo le sue dinamiche (Miyawaki et al. 1999,Palmer and Tsien. 2006). In questo studio si riporta lo sviluppo di una nuova serie di costrutti in cui le sonde Cameleon sono state indirizzate a differenti compartimenti intracellulari (mitocondri, reticolo endoplasmatico e plastidi/cloroplasti) ed i costrutti generati sono stati introdotti stabilmente nella pianta modello Arabidopsis thaliana. Nello specifico, le sonde Cameleon localizzate nei mitocondri e nel reticolo endoplasmatico (ER) sono state efficientemente espresse in piante selvatiche (wild type), mentre l’espressione costitutiva della sonda localizzata nei cloroplasti/plastidi è stata inficiata da un fenomeno di silenziamento genico post trascrizionale. Per ovviare ciò, la sonda è stata introdotta nella linea mutante rdr6 di A. thaliana (Peragine et al. 2004) la quale, presentando una soppressione del processo di silenziamento, ha permesso la costitutiva espressione della sonda Cameleon indirizzata ai plastidi/cloroplasti. Nella prima parte di questo dottorato sono stati condotti una serie di esperimenti volti allo studio delle dinamiche del Ca2+ nella matrice mitocondriale, utilizzando le sonde Cameleon D3cpV e YC3.6 (Kd 600nM e Kd 250nM rispettivamente). Gli esperimenti condotti, hanno rivelato che entrambe le sonde (4mt-YC3.6 e 4mt-D3cpv) permettono di monitorare le dinamiche del Ca2+ in questi organelli. Il confronto sulla funzionalità delle due sonde ha però evidenziato che la sonda YC3.6 è in grado di offrire una migliore sensibilità, come dimostrato da un intervallo dinamico più ampio, ovvero a parità di variazioni di Ca2+ questa sonda mostra una maggiore variazione nell’efficienza di FRET. Inoltre, il confronto delle dinamiche del Ca2+ misurate con le due sonde suggerisce che le misure ottenute con la sonda YC3.6 non siano inficiate da una eventuale interazione con la CaM mitocondriale endogena. Le analisi condotte con la linea 4mt-YC3.6 mostrano che sottoponendo le piante a stress osmotico (nelle cellule di guardia) o trattandole con ATP extracellulare (eATP; nell’apice radicale) si induce un transiente di Ca2+ a livello del citosol che viene percepito dai mitocondri che a loro volta accumulano Ca2+ con dinamiche strettamente dipendenti da quelle citosoliche. Successivamente, sono state condotte numerose analisi atte allo studio delle dinamiche del Ca2+ nel lume dell’ER. In questo compartimento sono state indirizzate le sonde Cameleon D1 (Kd1 0.8 e Kd2 60M) e D4 (Kd 195M). Nonostante la sonda D1 fosse stata precedentemente usata in cellule animali per monitorare le dinamiche del Ca2+ nell’ER (Palmer et al. 2004), le analisi condotte con la linea di A. thaliana esprimente la sonda CRT-D1ER hanno evidenziato che quest’ultima non mostrava nessuna variazione di FRET in risposta ad una serie di stimoli noti indurre transienti di Ca2+ citosolici. Al contrario la linea di A. thaliana esprimente la sonda CRT-D4ER si è rivelata essere in grado di monitorare lo stato e le dinamiche del Ca2+ in questo compartimento. Con l’uso di questa linea transgenica abbiamo valutato, attraverso un approccio farmacologico, il contributo di due classi di Ca2+-ATPasi (ECA e ACA) nel mantenimento dell’omeostasi del Ca2+ luminale. I risultati hanno rivelato che le pompe ECA hanno un ruolo fondamentale nell’accumulo del Ca2+ nell’ER, dato che la loro inibizione comporta una sensibile diminuzione della concentrazione di Ca2+ nel lume. Inoltre sono state analizzate le dinamiche del Ca2+ in risposta a diversi stimoli come il glutammato, eATP, NaCl e l’alternata imposizione di un tampone per la de-polarizzazione e iper-polarizzazione della membrana plasmatica. Era noto che gli stimoli analizzati provocassero transienti di Ca2+ nel citosol e le analisi condotte nel lume dell’ER hanno mostrato che, anche questo compartimento, percepisce gli stimoli somministrati accumulando Ca2+. Questi risultati suggeriscono che l’ER in pianta abbia un ruolo diverso rispetto a quello che ha nelle cellule animali. Infatti, i risultati dimostrano che l’ER in pianta è in grado di accumulare Ca2+ sequestrandolo dal citosol e rilasciarlo lentamente, mentre in cellule animali l’ER è anche un’importante sorgente di Ca2+, che interviene nella formazione del transiente citosolico, comportamento non osservato nelle condizioni da noi analizzate. Nell’ultima parte del mio triennio di dottorato sono state analizzate le dinamiche del Ca2+ nei plastidi e nei cloroplasti, in particolare, sono state saggiate la funzionalità di due sonde Cameleon, sia per espandere l’intervallo delle concentrazioni di Ca2+ analizzabili in questi organelli sia per verificare quale sonda rappresentasse la miglior opzione. La prima sonda scelta è stata la YC3.6 (2Bam4-YC3.6) in quanto in letteratura è riportata una concentrazione basale di Ca2+ nei cloroplasti nell’ordine delle centinaia di nano-moli/L, simile alla concentrazione del citosol (Nomura et al. 2012). La seconda sonda indirizzata ai cloroplasti/plastidi è stata la YC4.6 (2Bam4-YC4.6), che presentando in vitro una curva di affinità bifasica per il Ca2+ (Kd 56nM and 14M) può essere potenzialmente utilizzata per analizzare variazioni di Ca2+ in un intervallo di concentrazioni più ampio. Al fine di valutare se i plastidi siano in grado di accumulare Ca2+ in risposta ad uno stimolo capace di indurre un transiente citosolico, sono state analizzate, utilizzando le due linee transgeniche (2Bam4-YC3.6 e 2Bam4-YC4.6), le dinamiche del Ca2+ nell’apice radicale in risposta a diverse concentrazioni di eATP. Dall’analisi di questi dati si è rilevata una dose-dipendenza nella risposta in termini di Ca2+, misurata con entrambe le linee. Tale dose-dipendenza è stata registrata anche nel citosol suggerendo una stretta correlazione tra le dinamiche dei due compartimenti, l’accumulo plastidiale potrebbe, infatti, essere dovuto al transiente di Ca2+ citosolico. Successivamente è stato studiato il signaling del Ca2+ indotto nei cloroplasti delle cellule di guardia in seguito alla transizione luce-buio. La transizione luce-buio ha indotto un transiente di Ca2+ cloroplastico sostenuto nel tempo e già descritto in precedenza (Nomura et al. 2012,Sai and Johnson. 2002) in cui però è stata osservata una componente oscillatoria, sovrapposta a quella sostenuta, caratterizzata da transienti rapidi e successivi distinguibili come singoli picchi. I risultati ottenuti suggeriscono che le due componenti siano generate da sorgenti di Ca2+ diverse: il transiente sostenuto sembra collegato ad una riserva interna al cloroplasto, probabilmente il lume tilacoidale, mentre le oscillazioni sono generate da una riserva intracellulare, che potrebbe essere il citosol. Le dinamiche del Ca2+ nel cloroplasto sono stata analizzate anche a livello di intera foglia, su questo sistema sono state condotte analisi preliminari sulla risposta allo stress da ferita. Il danneggiamento del tessuto fogliare, ha comportato, nelle cellule circostanti alla zona danneggiata, l’induzione di un transiente di Ca2+ nel citosol e contemporaneamente un transiente di Ca2+ nei cloroplasti. Riassumendo, in questo lavoro sono state caratterizzate le dinamiche del Ca2+ in diversi compartimenti intracellulari. È stata analizzata la risposta all’eATP in un tessuto complesso come l’apice radicale, i risultati hanno evidenziato come plastidi, mitocondri e ER siano coinvolti nel sequestro di Ca2+ dal citosol mostrando un accumulo di Ca2+ in risposta allo stimolo. Le linee generate in questo progetto di dottorato hanno permesso di valutare nello specifico le diverse e caratteristiche dinamiche di ciascun compartimento. I risultati, inoltre, suggeriscono che la fonte intracellulare di Ca2+ coinvolta nella formazione del transiente citosolico in risposta all’eATP potrebbe essere rappresentata dal vacuolo. Sono state caratterizzate inoltre le dinamiche del Ca2+ nei mitocondri e nei cloroplasti a livello di singola cellula, studiando il sistema modello cellula di guardia durante la transizione luce-buio. I risultati hanno mostrato che solo i cloroplasti sono sensibili a questo stimolo, infatti, i mitocondri non mostrano transienti di Ca2+. In conclusione, nel presente lavoro si riporta lo sviluppo di una serie di nuovi strumenti molecolari per le analisi delle dinamiche del Ca2+ in diversi compartimenti intracellulari nelle cellule vegetali. Le linee transgeniche generate in questo progetto di dottorato saranno quindi utili per identificare il ruolo degli organelli nelle vie di trasduzione del segnale Ca2+ attivate in risposta a stress ambientali e/o a segnali di sviluppo.