Monostrati organici supportati su nanoparticelle d'€™oro per catalisi e riconoscimento molecolare

During the last decades gold nanoparticles have proven to be an attractive scaffold for the realization of inorganic-organic hybrid systems. This occurs by exploiting the stable interaction between gold surfaces and different classes of functional groups (like amines, phosphonates and -in particular- thiols) in order to prepare self-assembled monolayers.[1] This kind of system has been used in a wide range of applications in nanomedicine, diagnostics and nanotechnology. It has also become an attractive platform for the development of innovative, nanoparticle-based catalysts. This is motivated by different features of the gold nanoparticles, such as the ease and versatility of preparation, the possibility to retrieve the catalyst from solution and the high surface to volume ratio of gold colloids.[2] In a recent contribution by Prins et al.[3] a model of artificial nuclease, based on TACN-Zn(II)-bearing 2 nm diameter nanoparticles, initially developed by Scrimin et al.[4], has been exploited as a sensing tool for the detection of proteolytic enzymes in solution. The sensing mechanism relies on the inhibition of the transphosphorylation reaction of the substrate HPNP (2-hydroxypropyl-4-nitrophenyl phosphate), which can be followed spectrophotometrically as the reporter molecule p-nitrophenate is released, due to the interaction between the nanoparticles and a negatively charged oligopeptide. The oligopeptide plays a double role in the system by acting both as a nanoparticle inhibitor (by blocking access to the substrate to the catalytic sites on the surface of the monolayer) and an enzymatic substrate. The cleavage of the oligopeptide allows for the regulation of the catalytic behavior of the system, depending on the presence of the specific enzyme, since the lesser charged fragments are not good inhibitors of the catalyst. The interest towards the improvement of this system has directed the research presented in this thesis, in particular focusing on the role and stability of the monolayer. These studies relied on the analysis of the catalytic parameters and the binding of oligoanions of structurally related monolayers supported on gold nanoparticles. The first step of this research project was aimed at the synthesis of three organic building blocks, in which the thiol moiety and the macrocycle are separated by alkyl chains of different lengths (6, 9, 12 carbon atoms). The preparation and characterization of three batches of gold nanoparticles, each coated with one of the thiols, demonstrated a similar behaviour for Au NPs C9TACN and Au NPs C12TACN, whereas Au NPs C6TACN showed a denser monolayer presumably due to a more efficient lateral interaction between thiols. The evaluation of the catalytic activity in this model reaction mediated by the three systems showed the similarity between Au NPs C9TACN and Au NPs C12TACN in terms of intrinsic catalytic activity (kcat) and interaction with the substrate (KM), in good agreement with published data referred to a monolayer composed of longer thiols.[5] Au NPs C6TACN exhibited a similar value of kcat, but displaying a KM value that was 3-fold higher, indicative of the weaker interaction between the nanoparticles and the substrate. In order to study this phenomenon in more detail, the interaction between gold nanoparticles and fluorescent oligoanion was studied. Exploiting the quenching of luminescence mediated by the gold cores, it was possible to observe differences in the saturation concentration of the monolayer for different fluorescent probes. A first probe (fATP), known for a predominantly electrostatic interaction with the surface of the monolayer[6], gave hardly any differences between the three nanosystems. However a different probe (MANT-AMP), that binds the monolayer as a result of both electrostatic and hydrophobic interaction[7], clear differences were observed between Au NPs C6TACN and Au NPs C9TACN. By working in absence of Zn(II) at basic pH, in order to keep the monolayer uncharged, we were able to observe the lack of interaction between MANT-AMP and Au NPs C6TACN, confirming that for this system the apolar part of the monolayer does not participate to the binding process as we observed in the binding to the catalytic substrate. This is in agreement with the higher KM values observed in the catalysis experiments. Nonetheless these experiments do not reveal whether this is a consequence of the different thickness of the monolayer or whether it’s due to the peculiar density of the Au NPs C6TACN’s monolayer. Next, the binding and catalytic performances of the three systems were assessed over a time span of four months in order to understand their long term stability. So far few studies have appreared in the literature that address this important issue. All the systems resulted stable in time, without displaying aggregation or a radical deterioration of the catalytic parameters. Au NPs C9TACN was the only system that shown no variation at all in the catalytic and binding behavior, thus emerging as as the most robust system for applications. Finally, the effect of the nanoparticle dimensions on the catalytic activity was investigated by studying 13 nm gold nanoparticles passivated with thiol C9TACN. The catalytic parameters were then confronted with those obtained for Au NPs C9TACN (2 nm). The results showed that the system retains catalytic activity, but with a neat loss both in kcat and KM, probably imputable to the uniformity of the monolayer and the lack of “hot catalytic spots” that may occur in small nanoparticles with extreme curvatures.

Nel corso dei decenni le nanoparticelle dâ€'oro si sono dimostrate supporti estremamente attraenti per la realizzazione di sistemi ibridi inorganici-organici, sfruttando l'€™interazione stabile che si crea tra superfici d'€™oro e particolari classi di molecole organiche (come ammine, fosfonati o tioli) per formare monostrati autoassemblati.[1] Questo tipo di sistemi è stato sfruttato ampiamente per una vasta gamma di applicazioni, tra cui spicca la realizzazione di catalizzatori organici nano-supportati. La motivazione dietro l’interesse verso le nanoparticelle d'€™oro per applicazioni catalitiche risiede nella versatilità  della realizzazione del monostrato, virtualmente applicabile ad ogni tipo di reazione catalizzata da molecole organiche, e dall'€™enorme rapporto superficie/volume dei colloidi d'™oro.[2] In un recente lavoro di Prins et al.[3], impiegando un sistema catalitico ideato da Scrimin et al. per l’idrolisi di fosfodiesteri[4], si utilizzano nanoparticelle d'oro di 2 nm di diametro che espongono complessi di 1,4,7-triazaciclononano-Zn(II) come effettori di uno strumento di sensing per enzimi proteolitici. Tale sistema si basa sull’inibizione della reazione di transfosforilazione di HPNP (2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato) promossa dalle nanoparticelle ed osservabile per via spettrofotometrica seguendo la liberazione della molecola reporter p-nitrofenato, dovuta all'€™interazione tra la nanoparticella d'€™oro e oligopeptidi carichi negativamente. L'oligopeptide agisce nel doppio ruolo di inibitore della nanoparticella e di substrato enzimatico, regolando il sistema dipendentemente dalla presenza o meno di un enzima in grado di degradarlo in frammenti a carica inferiore che non inibiscono efficacemente la nanoparticella. L’interesse verso il perfezionamento di tale sistema ha spinto allo studio discusso in questo elaborato di tesi, utilizzando la catalisi della transfosforilazione di HPNP e la capacità  di interazione con oligoanioni come strumenti diagnostici di monostrati organici analoghi. Lo studio ha portato alla sintesi di tre building blocks organici, in cui il residuo tiolico e il macrociclo sono separati da catene alchiliche di diverse lunghezze (6, 9, 12 atomi di carbonio). In prima analisi viene discussa la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle d’oro passivate con i tre tioli (C6TACN, C9TACN, C12TACN), in cui si evidenziano poche differenze in termini qualitativi tra Au NPs C9TACN e Au NPs C12TACN. Au NPs C6TACN dimostrano un monostrato più¹ densamente popolato, probabilmente dovuto ad interazione laterali reciproche più efficenti tra i tioli all'€™interno del monostrato. La valutazione della catalisi dei tre sistemi sulla reazione modello ha evidenziato una similitudine tra Au NPs C9TACN e Au NPs C12TACN in termini di attività  catalitica (kcat) ed interazione con il substrato (KM), senza discostarsi in maniera rilevante dai sistemi studiati nei lavori precedenti, dotati di un tiolo più lungo.[5] Au NPs C6TACN, nonostante mantenga pressochè inalterato kcat rispetto ai due sistemi analoghi, presenta un KM di circa tre volte più elevato, indice di interazione più debole del sistema col substrato. Al fine di studiare il processo di binding tra nanoparticella e oligoanione in maniera più ampia si è ricorso allo studio dell'™interazione delle nanoparticelle sintetizzate con oligoanioni fluorescenti, sfruttando il peculiare quenching della luminescenza mediato dai core d'€™oro per determinare la concentrazione di saturazione del monostrato.[6] L'€™utilizzo di un primo probe fluorescente (fATP), in cui l'interazione con la nanoparticella è mediato in larga misura da carica elettrostatica, ha evidenziato differenze minime tra i tre diversi campioni. Utilizzando un probe (MANT-AMP) in cui vi è un bilancio tra interazione elettrostatica (con la superfice del monostrato) ed idrofobica[7] (con la parte alchilica interna del monostrato) si sono evidenziate differenze sostanziali tra Au NPs C6TACN e Au NPs C9TACN. Tale esperimento è risultato in una assenza di quenching per Au NPs C12TACN, verificando l'™avvenuto binding con un esperimento di displacement indipendente. Il fenomeno è ritenuto imputabile ad un orientamento sfavorevole al quenching del probe nel monostrato. Lavorando in assenza di Zn(II) e a pH nettamente basico al fine di mantenere il monostrato privo di carica, si è potuto osservare una totale assenza di interazione tra MANT-AMP e Au NPs C6TACN, confermando come la differente natura del monostrato giochi un ruolo nell'€™interazione con molecole organiche che va al di là  dell'€™interazione elettrostatica, riscontrabile anche nell'interazione con il substrato catalitico. Questo effetto, seppur sicuramente attribuibile a differenze nella struttura del building block componente il monostrato, può essere dovuto sia al diverso spessore del monostrato sia alla particolare densità  del monostrato stesso per Au NPs C6TACN. Le performances catalitiche e di binding per oligoanioni dei tre sistemi sono state testate in un arco di tempo di 4 mesi per stabilire quale sistema mantenesse tali parametri nel tempo, allo scopo di ottenere informazioni sulla stabilità  dei tre sistemi. Tutti i sistemi si sono rivelati relativamente ben stabili nel tempo, senza dimostrare aggregazione o deterioramento consistente dei parametri osservati. Au NPs C9TACN, contrariamente ai sistemi analoghi, non ha dimostrato alcuna variazione apprezzabile nei valori osservati, confermandosi il sistema più robusto. In ultima analisi è stato preso in considerazione il ruolo delle dimensioni della nanoparticella nell'€™evento catalitico. La sintesi e caratterizzazione di un sistema composto da nanoparticelle di 13 nm di diametro e passivato da tiolo C9TACN ha permesso di confrontarne le performance catalitiche con quelle del sistema analogo utilizzato nello studio precedente. I risultati dimostrano come il sistema sia ancora cataliticamente attivo, con un netto peggioramento dell'attività  catalitica e del binding del substrato rispetto all'analogo supportato su nanoparticelle di diametro 2 nm. Questi risultati possono essere imputati alla mancanza di "œhot spot" catalitici presenti in nanoparticelle piccole e con curvature accentuate.