Effetto della disfunzione epatica sull'induzione enzimatica: valutazione dell'inducibilità dei CYP1A e CYP3A in ratti con cirrosi sperimentalmente indotta

Background and aims: Although induction has long been investigated in patients with cirrhosis, highly discrepant results have been obtained; moreover, the mechanism underlying the possible effect of cirrhosis on induction has not been clarified. This study was designed to compare induction of CYP1A and CYP3A enzymes in healthy rats and rats with experimentally induced liver cirrhosis. Since differences in CYP1A induction in Sprague-Dawley and Wistar rats have been reported, the secondary aim of this study was to quantify the magnitude of CYP1A induction in these two rat strains. Methods: We used 3 groups of male Wistar rats, one of healthy animals and two groups of rats with carbon tetrachloride (CCl4)-induced cirrhosis, stratified according to the degree of liver dysfunction. Each group was divided in 2 subgroups of 8 rats, one treated with vehicle (oil), the other with an inducing agent [benzo[a]pyrene (BaP) or dexamethasone (DEX) for CYP1A and CYP3A, respectively]. To investigate the difference between Sprague-Dawley and Wistar rats, we used 2 groups of 8 healthy animals for each strain: one treated with vehicle, the other treated with BaP. The inducing effect was assessed by measuring the activity of CYP1A and CYP3A enzymes, using O-dealkylation of ethoxyresorufin and methoxyresorufin, and hydroxylation of testosterone and midazolam as markes reactions, respectively. Western blot analysis and qRT-PCR were performed to evaluate protein and gene expression of CYP1A, CYP3A and nuclear receptors responsible for their transcriptional control (Aryl Hydrocarbon receptor and Pregnane X Receptor, respectively). Results and conclusion: 1) BaP treatment increased mRNA and protein expression of both CYP1A enzymes (CYP1A1 and CYP1A2) and AhR to a greater extent in Wistar than Sprague-Dawley rats. By contrast, CYP1A2 enzyme activity was much more markedly increased in Sprague-Dawley than Wistar rats and CYP1A1 activity was induced to similar levels in the two rat strains. A BaP-induced increase in the turnover number of CYP1A enzymes in Sprague-Dawley rats, relative to Wistar rats, may provide a plausible explanation for the differential effect of BaP on gene expression and enzyme activity in these rat strains. 2) The inducibility of CYP1A enzymes is well preserved in non ascitic rats, whereas it is markedly reduced when liver dysfunction becomes severe. Induction appears to be impaired at the transcriptional level, due to the reduced expression of AhR, which controls the transcription of CYP1A genes. 3) Cirrhosis has a differential effect on the induction by DEX of the two CYP3A isoforms CYP3A1 and CYP3A2. The induction of CYP3A1 mRNA and protein is well preserved in both compensated and decompensated cirrhosis, whereas that of CYP3A2 is markedly reduced when liver dysfunction becomes severe. Consistently, CYP3A1 activity is significantly increased in DEX-treated rats irrespective of the degree of liver dysfunction, whareas CYP3A2 activity is not significantly induced in ascitic rats after DEX treatment. At variance with AhR, no significant increase in PXR gene and protein expression is observed in DEX-treated healthy or cirrhotic rats. In conclusion, the effect of cirrhosis on enzyme induction is dependent in the type of nuclear receptor that mediates the inducing effect. Therefore, no generalization can be made and the influence of cirrhosis on inducibility has to be assessed for each class of inducing agents

Introduzione e scopo: Anche se l'induzione è stata a lungo studiata nei pazienti con cirrosi, i risultati ottenuti sono stati contrastanti; inoltre, il meccanismo alla base del possibile effetto della cirrosi sull'induzione non è stato chiarito. Questo studio è stato svolto per confrontare l'induzione degli enzimi CYP1A e CYP3A in ratti sani e con cirrosi indotta sperimentalmente. Poiché sono state riportate differenze nell’induzione del CYP1A in ratti Sprague-Dawley e Wistar, scopo secondario di questo studio è stato quello di quantificare l'entità dell'induzione del CYP1A in questi due ceppi di ratto. Metodi: Sono stati utilizzati 3 gruppi di ratti Wistar maschi, uno di animali sani e due gruppi di ratti con cirrosi indotta con tetracloruro di carbonio (CCl4), stratificati in base al grado di disfunzione epatica. Ogni gruppo è stato diviso in due sottogruppi di 8 ratti, uno trattato con il veicolo (olio), l'altro con un agente inducente [benzo[a]pirene (BaP) o desametasone (DEX) per CYP1A e CYP3A, rispettivamente]. Per il confronto tra i ratti Sprague-Dawley e Wistar sono stati usati 2 gruppi di 8 animali sani per ogni ceppo: uno trattato con veicolo, l'altro trattato con BaP. L'inducibilità è stata valutata misurando l'attività enzimatica, utilizzando l’O-dealchilazione della 7-etossiresorufina e della 7-metossiresorufina, e l’idrossilazione di testosterone e midazolam, come reazioni marker di CYP1A e CYP3A, rispettivamente. Sono state eseguite analisi di qRT -PCR e Western Blot per valutare l'espressione genica e proteica dei CYP1A, CYP3A e dei recettori nucleari responsabili del loro controllo trascrizionale [Aryl Hydrocarbon receptor (AhR) and Pregnane X Receptor (PXR), rispettivamente]. Risultati e conclusioni: 1) Il trattamento con BaP aumenta l’espressione genica e proteica di entrambe le isoforme di CYP1A (CYP1A1 e CYP1A2) e dell’AhR in misura maggiore nei ratti Wistar che in quelli Sprague-Dawley. Al contrario, l'attività del CYP1A2 è aumentata in modo maggiore negli Sprague-Dawley rispetto ai Wistar e l'attività del CYP1A1 è indotta a livelli simili nei due ceppi di ratto. Una spiegazione plausibile per l'effetto differenziale del BaP su espressione e attività enzimatica dei CYP1A in questi ceppi di ratto può essere un diverso turnover number dei CYP1A indotti nei ratti Sprague-Dawley e Wistar. 2) L'inducibilità del CYP1A è ben conservata nei ratti cirrotici non ascitici, mentre è notevolmente ridotta in quelli ascitici. Tale riduzione appare causata dalla ridotta espressione dell’AhR, che controlla la trascrizione di geni del CYP1A. 3) La cirrosi ha un effetto differenziale sull’induzione prodotta dal DEX delle due isoforme di CYP3A: CYP3A1 e CYP3A2. L'induzione dell’espressione genica e proteica del CYP3A1 è conservata nella cirrosi sia compensata che scompensata, mentre quella del CYP3A2 viene notevolmente ridotta in seguito all’aggravarsi della disfunzione epatica. Coerentemente con questi risultati, l'attività CYP3A1 è significativamente aumentata nei ratti trattati con DEX indipendentemente dal grado di disfunzione epatica, mentre l’attività del CYP3A2 non è significativamente indotta nei ratti ascitici dopo il trattamento con DEX. A differenza di quanto osservato per l’AhR, non è stato osservato alcun aumento significativo dell’espressione del PXR nei ratti trattati con DEX, sia sani che cirrotici. Si può quindi concludere che l'effetto della cirrosi sull’induzione enzimatica dipende dal tipo di recettore nucleare coinvolto. Pertanto, non può essere fatta nessuna generalizzazione e l'influenza della cirrosi sull’inducilità dei CYP deve essere valutata per ogni classe di induttori