Computational methods for the analysis of gene expression from RNA sequencing data

In every living organism, the entirety of its hereditary information is encoded, in the form of DNA, through the so-called genome. The genome consists in both genes and non-coding sequences and contains the whole information needed to determine all the properties and functions of each single cell. Cells can access and translate specific instructions of this code through gene expression, namely by selectively switching on and off a particular set of genes. Thanks to gene expression, the information encoded into the active genes is transcribed into RNAs. This set of RNAs reflects the current state of a cell and can reveal pathological mechanisms underlying diseases. In recent years, a novel methodology for RNA sequencing, called RNA-seq, is replacing microarrays for the study of gene expression. The sequencing framework of RNA-seq methodology enables to investigate at high resolution all the RNA species present in a sample, characterizing their sequences and quantifying their abundances at the same time. In practice, millions of short sequences, called reads, are sequenced from random positions of the input RNAs. These reads can then be computationally mapped on a reference genome to reveal a transcriptional map, where the number of reads aligned on each gene, called counts, gives a measure of its level of expression. At first glance, this scheme may seem very simple, but the implementation of the whole analysis workflow is in fact complex and not well defined. So far, many computational methods have been proposed to perform the different steps of RNA-seq data analysis, but a unified processing pipeline is still lacking. The aim of my Ph.D. research project was the implementation of a robust computational pipeline for RNA-seq data analysis, from data pre-processing to differential expression detection. The definition of the different analysis modules was carried out through several steps. First, we drafted a basic analysis framework through the study of RNA-seq data features and the dissection of data models and state-of-the-art algorithmic strategies. Then, we focused on count bias, which is one of the most challenging aspects of RNA-seq data analysis. We demonstrated that some biases affecting counts can be effectively corrected with current normalization methods, while others, like length bias, cannot be completely removed without introducing additional systematic errors. Thus, we defined a novel approach to compute RNA-seq counts, which strongly reduces length bias prior to normalization and is robust to the upstream processing steps. Finally, we defined the complete analysis pipeline considering the best preforming methods and optimized some specific processing steps to enable correct expression estimates even in the presence of high-similarity genomic sequences. The implemented analysis pipeline was applied to a real case study to identify the genes involved in the pathogenesis of spinal muscular atrophy (SMA) from RNA-seq data of patients and healthy controls. SMA is a degenerative neuromuscular disease that has no cure and represents one of the major genetic causes of infant mortality. We identified a set of genes related to skeletal muscle and connective tissue disorders whose patterns of differential expression correlate with phenotype and may underlie protective mechanisms against SMA progression. Some putative positive targets identified by this analysis are currently under biological validation since they might improve diagnostic screening and therapy. To pose the basis for future research, which will focus on the optimization of the processing pipeline and to its extension to the analysis of dynamic expression data, we designed two time-series RNA-seq data sets: a real one and a simulated one. The experimental and sequencing design of the real data set, as well as the modelling of the synthetic data, have been an integral part of the Ph.D. activity. Overall, this thesis considers each step of the RNA-seq data processing and provides some valuable guidelines in a fast-evolving research field that, up to now, has prevented the establishment of a stable and standardized analysis scheme.

Il patrimonio genetico di ogni organismo vivente è codificato, sotto forma di DNA, nel genoma. Il genoma è costituito da geni e da sequenze non codificanti e racchiude in sé tutte le informazioni necessarie al corretto funzionamento delle cellule dell'organismo. Le cellule possono accedere a specifiche istruzioni di questo codice tramite un processo chiamato espressione genica, ovvero attivando o disattivando un particolare set di geni e trascrivendo l'informazione necessaria in RNA. L'insieme degli RNA trascritti caratterizza quindi un preciso stato cellulare e può fornire importanti informazioni sui meccanismi coinvolti nella patogenesi di una malattia. Recentemente, una metodologia per il sequenziamento dell'RNA, chiamata RNA-seq, sta rapidamente sostituendo i microarray nello studio dell'espressione genica. Grazie alle proprietà delle tecnologie di sequenziamento su cui è basato, l'RNA-seq permette di misurare il numero di RNA presenti in un campione e al contempo di "leggerne" l'esatta sequenza. In realtà, il sequenziamento produce milioni di sequenze, chiamate "read", che rappresentano piccole stringhe lette da posizioni random degli RNA in input. Le read devono quindi essere mappate con un algoritmo su un genoma di riferimento, in modo da ricostruire una mappa trascrizionale, in cui il numero di read allineate su ciascun gene dà una misura digitale (chiamata "count") del suo livello di espressione. Sebbene a prima vista questa procedura possa sembrare molto semplice, lo schema di analisi integrale è in realtà molto complesso e non ben definito. In questi anni sono stati sviluppati diversi metodi per ciascuna delle fasi di elaborazione, ma non è stata tuttora definita una pipeline di analisi dei dati RNA-seq standardizzata. L'obiettivo principale del mio progetto di dottorato è stato lo sviluppo di una pipeline computazionale per l'analisi di dati RNA-seq, dal pre-processing alla misura dell'espressione genica differenziale. I diversi moduli di elaborazione sono stati definiti e implementati tramite una serie di passi successivi. Inizialmente, abbiamo considerato e ridefinito metodi e modelli per la descrizione e l'elaborazione dei dati, in modo da stabilire uno schema di analisi preliminare. In seguito, abbiamo considerato più attentamente uno degli aspetti più problematici dell'analisi dei dati RNA-seq: la correzione dei bias presenti nei count. Abbiamo dimostrato che alcuni di questi bias possono essere corretti in modo efficace tramite le tecniche di normalizzazione correnti, mentre altri, ad esempio il "length bias", non possono essere completamente rimossi senza introdurre ulteriori errori sistematici. Abbiamo quindi definito e testato un nuovo approccio per il calcolo dei count che minimizza i bias ancora prima di procedere con un'eventuale normalizzazione. Infine, abbiamo implementato la pipeline di analisi completa considerando gli algoritmi più robusti e accurati, selezionati nelle fasi precedenti, e ottimizzato alcun step in modo da garantire stime dell'espressione genica accurate anche in presenza di geni ad alta similarità. La pipeline implementata è stata in seguito applicata ad un caso di studio reale, per identificare i geni coinvolti nella patogenesi dell'atrofia muscolare spinale (SMA). La SMA è una malattia neuromuscolare degenerativa che costituisce una delle principali cause genetiche di morte infantile e per la quale non sono ad oggi disponibili né una cura né un trattamento efficace. Con la nostra analisi abbiamo identificato un insieme di geni legati ad altre malattie del tessuto connettivo e muscoloscheletrico i cui pattern di espressione differenziale correlano con il fenotipo, e che quindi potrebbero rappresentare dei meccanismi protettivi in grado di combattere i sintomi della SMA. Alcuni di questi target putativi sono in via di validazione poiché potrebbero portare allo sviluppo di strumenti efficaci per lo screening diagnostico e il trattamento di questa malattia. Gli obiettivi futuri riguardano l'ottimizzazione della pipeline definita in questa tesi e la sua estensione all'analisi di dati dinamici da "time-series RNA-seq". A questo scopo, abbiamo definito il design di due data set "time-series", uno reale e uno simulato. La progettazione del design sperimentale e del sequenziamento del data set reale, nonché la modellazione dei dati simulati, sono stati parte integrante dell'attività di ricerca svolta durante il dottorato. L'evoluzione rapida e costante che ha caratterizzato i metodi per l'analisi di dati RNA-seq ha impedito fino ad ora la definizione di uno schema di analisi standardizzato e la risoluzione di problematiche legate a diversi aspetti dell'elaborazione, quali ad esempio la normalizzazione. In questo contesto, la pipeline definita in questa tesi e, più in ampiamente, i temi discussi in ciascun capitolo, toccano tutti i diversi aspetti dell'analisi dei dati RNA-seq e forniscono delle linee guida utili a definire un approccio computazionale efficace e robusto.