Human tissue-on-a-chip development for Type 2 Diabetes studies

Type 2 Diabetes (T2D) results from an insulin resistance condition that affects mainly adipose and skeletal muscle tissues by altering their glucose uptake and leading to major clinical complications. Moreover, it is known that these tissues interact each other with a negative cross-talk that worsen the pathology. Due to its clinical complexity, T2D would require patient-specific treatment. In this context it will be extremely helpful to have in vitro human tissue-based assays, able to provide biological responses representative of the in vivo patient-specific pathology. The aim of this PhD thesis is the development and integration of human tissue models in a microfluidic technology, for in vitro T2D drug testing on patient-derived tissues. More specifically, to develop a new tool with the capability to dissect, reproduce and study tissue interactions in multi-organs derived pathologies, that allows to carry out biological investigations on human insulin-resistant tissue models which are exposed to fast physiological and pathological stimuli. Integration “on-a-chip” of skeletal muscle and adipose tissues and their applications are presented in this thesis. These tissues were chosen for their involvement in T2D. A myoblasts model integrated in a microfluidic technology and coupled with glucose FRET-based nanosensing is described. Through microfluidic technology it was possible to monitor extracellular glucose concentration with high temporal resolution with minimum disruption of cell culture condition, while glucose FRET nanosensing permitted to measure cytosolic glucose concentration in live cells. With the assistance of mathematical modeling and data analyses it was possible to derive from experimental data the kinetic parameters involved in glucose handling (glucose diffusion through plasma membrane and intracellular glucose phosphorylation). On its side, adipose tissue organ cultures was integrated in an automated microfluidic chip which is able to provide temporally controlled stimulations (e.g. insulin or drugs), allowing significant flexibility of the experiments. This tissue model showed high viability and metabolic activity, high flow rate sensitivity in high resolution glucose uptake measurements and robustness. Finally, it is presented the integration of human skeletal muscle in a microfluidic device. For the development of this in vitro tissue, micropattern techniques were coupled and applied in order to have a better control on cell topology. It has been studied the effect of different-width of pattern lanes on myoblasts proliferation and differentiation. Wider lanes negatively affect cell proliferation, whereas they have a positive effect on myoblasts differentiation. Human myoblasts were successfully integrated and differentiated in the microfluidic chip with a 300-µm lanes pattern. Myotubes showed a high sarcomeric organization, outlining the obtainment of a tissue model very similar to the in vivo muscle. Moreover, it has been demonstrated that insulin pathway activation is conserved in physiological conditions, and that it can be deeply investigate through conventional molecular biology techniques. The skeletal muscle model on-a-chip was finally studied for the insulin resistance onset after treatment with adipose tissue conditioned medium. These results show a good potential in future pharmaceutical and clinical experimentation. In fact they give proofs that a new tool able to dissect and reproduce tissue interactions in multi-organs derived diseases, can be generated. With its support, it would be possible to overcome current limitation in therapy design, by reproducing in vitro models of the disease, even in a patient-specific way, in order to perform individual therapeutic development.

Il Diabete di tipo 2 insorge da una condizione di insulino-resistenza che colpisce soprattutto il tessuto muscolare e il tessuto adiposo, alterando il loro uptake di glucosio e portando a complicanze cliniche più gravi. È altresì noto che questi tessuti interagiscono tra loro con una comunicazione distruttiva che peggiora la patologia. A causa della sua complessità clinica, il Diabete di tipo 2 richiede spesso trattamenti paziente-specifici. In questo scenario, nasce la necessità di sviluppare un un modello in vitro umano capace di fornire risposte biologiche rilevanti e che sia rappresentativo della patologia in vivo specifica del paziente. L’obiettivo di questa tesi di dottorato è lo sviluppo e l’integrazione di modelli di tessuto umano derivati da pazienti affetti da Diabete di tipo 2 in una tecnologia microfluidica per svolgere screening di farmaci in vitro. Tale modello, permetterà di dissezionare, riprodurre e studiare le interazioni dei tessuti in patologie che coinvolgono più organi. In questo specifico caso, permetterà di investigare l’insulino-resistenza dei tessuti umani sottoposti a stimoli veloci, sia fisiologici che fisio-patologici. Considerato il loro ruolo centrale nell’insorgenza del Diabete, in questa tesi è presentata l’integrazione in una tecnologia “Lab-on-a-chip” di tessuto muscolare e tessuto adiposo. Un modello di mioblasti è stato utilizzato per lo studio delle dinamiche cellulari del glucosio. La tecnologia microfluidica in cui è stato integrato ha permesso di monitorare la concentrazione extracellulare di glucosio con un’alta risoluzione temporale, mantenendo integra nel contempo la coltura cellulare. Inoltre l’uso di un nanosensore intracellulare FRET specifico per il glucosio ha permesso di misurare la concentrazione citosolica del metabolita in mioblasti vivi. Avvalendosi di modellazione matematica e analitica dei dati sperimentali è stato possibile calcolare i parametri cinetici propri del glucosio in una cellula: nello specifico sono state calcolate le cinetiche del trasporto attraverso la membrana citosolica e della fosforilazione intracellulare. Il tessuto adiposo è stato invece integrato come organo-coltura in un chip microfluidico automatizzato, il quale è in grado di fornire stimoli di insulina o farmaci controllati nel tempo, rendendo flessibile la possibilità di sperimentazione. Il tessuto adiposo da parte sua ha mostrato elevate vitalità e attività metabolica, un’alta sensibilità alla portata del medium durante le misure di uptake di glucosio e soprattutto una elevata ripetibilità sperimentale. Infine, viene presentata l’integrazione in dispositivi microfluidici di tessuto muscolare umano accoppiando inoltre tecniche di micropattern per ottenere un migliore controllo della topologia cellulare in vitro. Innanzitutto è stato studiato l’effetto dovuto all’utilizzo di pattern a righe di diverse ampiezze sulla proliferazione e differenziamento dei mioblasti in vitro: maggiore è l’ampiezza delle righe del pattern, minore è la proliferazione e maggiore è il differenziamento. Il miglior pattern (composto da righe di 300 µm), è stato riprodotto all’interno di chip microfluidico. Mioblasti umani coltivati in questo sistema sono stati in grado di differenziare in miotubi caratterizzati da una elevata organizzazione sarcomerica. Inoltre è stato verificato il mantenimento dell’attivazione del pathway dell’insulina, risultato evidenziato adattando convenzionali tecniche di biologia molecolare ai piccoli volumi cellulari coinvolti. Il tessuto muscolare integrato in microfluidica è stato infine studiato sotto lo stimolo di medium condizionato da tessuto adiposo, mostrando l’insorgenza di insulino-resistenza. Questi risultati mostrano un elevato potenziale nel futuro delle sperimentazioni cliniche e farmaceutiche grazie alla possibilità di poter riprodurre in vitro le interazioni multi-organo di patologie complesse. Con il supporto di tali strumenti sarà possibile superare le attuali limitazioni presenti nello sviluppo di nuove terapie. Sarà infatti possibile riprodurre in vitro la patologia, anche in una maniera paziente-specifica, permettendo quindi l’attuazione di terapie personalizzate.