DEVELOPMENT OF HUMAN TISSUES ON A CHIP FROM PLURIPOTENT STEM CELLS

The development of new microscale technologies aimed at generating human tissues and organs on a chip is emerging as a novel effective strategy to perform cost effective and multi-parametric assays for disease modeling investigations and screening specific therapeutic strategies, as broadly recognized from the scientific community, the major pharmaceutical companies and the governmental agencies. The generation of human organs on a chip, in which microscale technologies, such as microfluidics, are combined with cultured human cells in order to mimic whole living organ environment, offers a unique opportunity to study human physiology and pathophysiology, resembling in vivo conditions. This technological perspective could provide an effective solution to the current limitations of animal models, which result highly expensive and non predictive of human physiology, and conventional cell culture models that fail to recapitulate complex, organ-level disease processes. The possibility of developing direct organogenesis on a chip from human pluripotent stem cells, which have the potential to generate all cellular types of the human body, could overcome the limited availability of human primary cells, such as human hepatocytes or cardiomyocytes. Moreover, the recent generation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from adult somatic cells through the ectopic expression of defined transcription factors, provides a new effective tool to obtain populations of patient-specific stem cells with distinctive genetic diversity. This work is aimed at the development of functional human tissues on a chip from pluripotent stem cells, to be used in developing new in vitro disease models or drug screening and toxicity assays, more predictive than current animal models, overcoming issues related to primary cell sources recruitment. To this purpose, an integrated microscale system, based on the microfluidic technology, was developed, in order to derive functional cardiac and hepatic tissues on a chip, from human pluripotent stem cells, through the accurate delivery of chemical compounds and growth factors, within cellular microenvironment, and proper regulation of exogenous and endogenous factors, which are known to affect embryonic development in vivo. These functionally differentiated cells on a chip can be directly used for multi-parametric and large-scale drug screening or for developing micro-engineered human organ models. This last aspect also requires to design new technology for assisting in vitro assays and developing new therapeutic strategies or for screening among potential clinical cures. In particular, design of proper functional assays to test cellular responses to drugs or external stimuli, such as mechanical stress or hypoxia, in a physiologic or pathologic context has been addressed. Thanks to the development of a microfluidic gas exchanger for generating rapid depletion of oxygen content in culture medium, the role of acute hypoxia in calcium handling machinery of a cardiomyocytes population was investigated, mimicking early effects of ischemia on cardiac microenvironment. Moreover, the role of cyclic mechanical stress, which plays a crucial role in the investigation of new physiological and pathological responses to cell culture microenvironment, was analyzed in a human Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in vitro model, through a microfluidic-based cell stretching device accurately reproducing cyclic mechanical deformations along time. The combination of tissues development on a chip and micro-technology assisting for functional assay on a chip opens new and substantial perespective in generating a human in vitro model that properly resemble the physiological and pathophysiological behaviro of a tissues or organs within humna body.

Lo sviluppo di nuove tecnologie di microscala volte a generare tessuti e organi umani on a chip si sta rivelando una nuova strategia per compiere esperimenti multi-parametrici a basso costo per sviluppo di modelli di malattia e screening di specifiche strategie terapeutiche, come ampiamente riconosciuto dalla comunità scientifica, dalle maggiori compagnie farmaceutiche e da agenzie governative. La generazione di organi umani on a chip, in cui le tecnologie di microscale, come la tecnologia microfluidica, sono combinate colture cellulari umane allo scopo di mimare l’intero ambiente di un organo vivente, offre un’opportunità unica per studiare la fisiologia e la fisiopatologia umane, in modo rappresentativo delle condizioni in vivo. Questa prospettiva tecnologica potrebbe fornire una soluzione efficace alle attuali limitazioni dei modelli animali, che si dimostrano altamente costosi e non predittivi della fisiologia umana, e dei modelli convenzionali di colture cellulari che non sono in grado di rappresentare i complessi processi che caratterizzano una patologia a livello di organo. La possibilità di rappresentare l’organogenesi direttammente on a chip partendo da cellule staminali umane pluripotenti, che hanno il potenziale per generare tutti I tipi cellular presenti nel corpo umano, consentirebbe di superare i limiti legati alla disponibilità di cellule primarie umane, come epatociti o cardiomiociti umani. Per di più, la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte da cellule somatiche adulte ottenuta di recente tramite l’espressione ectopica di fattori di trascrizione definiti, fornisce un nuovo mezzo per ottenere cellule staminali paziente-specifiche con diversità genetica specifica. Questo studio è volto allo sviluppo di tessuti funzionali umani on a chip partendo da cellule staminali pluripotenti, da usare nello sviluppo di nuovi modelli di patologie in vitro o per screening di farmaci e test di tossicità, con più capacità predittiva degli attuali modelli animali, superando i problemi legati al reclutamento di fonti cellulari primari. A questo proposito, è stato sviluppato un sistema su microscale integrato, basato sulla tecnologia microfluidica, al fine di derivare tessuti cardiaco ed epatico funzionali on a chip da cellule staminali umani pluripotenti, tramite la somministrazione accurata di composti chimici e fattori di crescita, all’interno del microambiente cellulare, e un’appropriata regolazione dei fattori esogeni ed endogeni, che hanno un effetto riconosciuto nello sviluppo embrionale in vivo. Queste cellule funzionalmente differenziate on a chip possono essere usate direttamente screening multi-parametrici e su larga scala di farmaci o per sviluppare modelli micro-ingegnerizzati di organo umano. Quest’ultimo aspetto richiede inoltre di progettare nuove tecnologie che assistano gli esperimenti in vitro e sviluppare nuove strategie terapeutiche o per scrinare potenziali cure cliniche. In particolare, la sono stati progettati test funzionali appropriati per valutare la risposta a farmaci o stimoli esterni, come lo stress meccanico o l’ipossia, in un contesto fisiologico o patologico. Grazie allo sviluppo di uno scambiatore di gas microfluidico per rimuovere velocemnete il contenuto di ossigeno nel medium di coltura, è stato analizzto il ruolo di un’ipossia acuta sulle dinamiche dei flussi del calcio, mimando gli effetti iniziali di un’ischemia nel microambiente cardiaco. Inoltre, è stato analizzato il ruolo dello stress meccanico ciclico, che svolge un ruolo cruciale nello studio di nuove risposte fisiologiche e patologiche al microambiente cellulare, in un modello in vitro di Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD), tramite un dispositivo di stretching cellulare basato sulla tecnologia microfluidica con cui è possibile riprodurre in modo accurato deformazioni meccaniche cicliche nel tempo. Combinando lo sviluppo di tessuti on a chip e microtecnologie che assistano test funzionali on a chip si aprono nuove e sostanziali prospettive nella generazione di un modello umano in vitro che riassuma le caratteristiche fisio-patologiche dei tessuti e organi all’interno del corpo umano.