Alfa-synuclein oligomers induced by docosahexaenoic acid: a study of activity and molecular characterization

Parkinson disease (PD) is the main neurodegenerative disease that involves motor symptoms. About 1% of population above 65 years is affected by PD. Main symptoms are bradikinesia, resting tremor, postural instability, muscle rigidity, and sometimes, cognitive problems and personality. Neuropathological features of PD are neuronal death in the substantia nigra pars compacta and formation of cytoplasmatic inclusion, named Lewy bodies, constituted by fibrillar form of α-synuclein (aS). aS is a 140 amino acid protein, whose structure and function is yet not well defined. As a consequence of specific genetic mutations or environmental factors, it undergoes aggregation and forms amyloid fibrils. It is highly expressed in neuronal pre-synaptic nerve terminals. Its sequence is characterized by an amphipathic lysine-rich amino terminus, which governs binding to lipids and interactions with membranes and contains seven imperfect repetition of the sequence KTKEGV; by a hydrophobic central region (NAC, non-amyloid component), responsible for protein aggregation and α-sheet formation and a highly acidic C-terminal, rich in Pro and acidic residues. Overexpression of aS and mutations in its gene are associated with a premature development of PD. Mechanism that make aS a toxic protein has not yet been well clarified, but it seems clear that oligomeric forms, and not the final fibrillar forms, are the main responsible for the pathogenesis of PD. The project of this thesis focuses on the characterization of oligomers of aS that form in the presence of docosahexaenoic acid (DHA), and their interaction with membrane, to understand the mechanism of toxicity. DHA is one of the most abundant fatty acids in neuronal membrane and it has been correlated to PD. It has been demonstrated that dopaminergic cell cultures exposed to PUFAs accumulate soluble cytotoxic aS oligomers (Assayag et al., 2007). Indeed, aS seems to be involved in fatty acids metabolism (Golovko et al., 2007). Moreover, it was reported that, in PD patients, DHA concentration is enhanced in those area affected by aS inclusions. In vivo studies demonstrated that a DHA enriched diet enhances formation of aS oligomers (Sharon et al., 2003). In previous studies in this laboratory, it was analyzed the aggregation process of aS in the presence of DHA using different protein to DHA molar ratios (De Franceschi et al., 2009; 2011). Oligomers obtained in these conditions were characterized from a morphological point of view (De Franceschi et al., 2011). The presence of DHA (50:1 lipid:protein molar ratio) leads to the formation of stable oligomers, off-pathway in the aggregation process of aS, that have significant toxic activity on cells, suggesting that they are potentially relevant in the pathogenesis of PD (De Franceschi et al., 2011). In the first part of this thesis a characterization of oligomers have been conducted using several biophysical methods, since these oligomers are sufficiently stable to allow the use of these techniques. In particular, transmission electron (TEM) and atomic force (AFM) microscopy were used to study oligomers morphology and dimension. The secondary structure was evaluated by circular dichroism (CD). This spectroscopic analysis reveals that oligomers have a partial α-helix structure, in contrast with the majority of oligomeric species described in literature. It was analyzed also the ability of oligomers to interact with membrane, using liposomes of different size and composition and cell cultures. Interaction of oligomers with membrane, analyzed by CD measurements and leakage assays, causes the leakage of small molecule, demonstrating their ability to destabilize membranes. Oligomers activity was tested also on dopaminergic cell culture that showed an altered permeabilization after treatment. To determine the mechanism by which oligomers cause membrane permeabilization, different tests were performed. Initially, dynamic light scattering (DLS) and TEM allow to exclude a detergent-like effect. Moreover, aggregation studies and planar lipid membrane (PLM) measurements lead to hypothesize a toxicity mechanism that depends on the formation of a transient aperture or on the enhancement of flip-flop. This part of the thesis is object of a publication (Fecchio et al., 2013). Another aspect faced in this thesis is the study of chemical modification occurring on oligomers after exposition to DHA. Different chemical modification were evidenced by mass spectrometry: carbonylation and the formation of adduct with DHA at the level of His50. To deepen the role of this residue in the interaction with FA, it was used an aS variant, H50Q, that has recently been linked to familiar form of PD. Finally, also the interaction with DHA of other pathological variants of aS (A30P, E46K, A53T) was studied. In particular their secondary structure and oligomerization in the presence of DHA were analyzed, in comparison with results obtained with aS. In conclusion, this study supplied further information about structure and activity of oligomeric species that are potentially relevant in PD pathogenesis. These data can be compared to oligomers produced in different conditions or formed by different amyloidogenic proteins: this knowledge would be fundamental to the development of therapeutic agent that would prevent or defeat these kind of debilitative diseases

Il morbo di Parkinson (PD) è la principale malattia neurodegenerativa riguardante la funzionalità motoria. L'1% della popolazione sopra i 65 anni è affetto da questa malattia. I sintomi principali sono bradichinesia, tremore a riposo, instabilità posturale, rigidità muscolare e, talvolta, problemi cognitivi e della personalità . Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la morte dei neuroni dopaminergici a livello della substantia nigra pars compacta e la formazione di corpi d'inclusione citoplasmatici composti da aggregati proteici fibrillari di tipo amiloide, Lewy bodies (LBs), il cui costituente principale è α-sinucleina (aS) (Spillantini et al., 1998). aS è proteina di 140 amminoacidi, natively unfolded, la cui funzione, nonostante il suo ruolo chiave nel PD, non è ancora completamente chiarita. E' espressa in livelli alti nel sistema nervoso centrale ed è abbondante nei terminali presinaptici neuronali. Strutturalmente è caratterizzata dalla presenza di sette ripetizioni imperfette di sequenza aminoacidica (KTKEGV) nella regione N-terminale, da una regione idrofobica centrale (NAC, non-amyloid component) e da una coda C-terminale con numerosi residui acidi. La sovraespressione di aS e mutazioni nel suo gene sono associati a forme precoci della sindrome di Parkinson. Il meccanismo con cui un cambiamento nella struttura e nell'espressione della proteina possa portare allo sviluppo della malattia non è ancora stato chiarito, ma è sempre pi๠accreditata l'ipotesi che siano le forme oligomeriche e non gli aggregati finali fibrillari ad essere responsabili della malattia. Il progetto di questa Tesi riguarda la caratterizzazione di oligomeri tossici di α-sinucleina (aS) ottenuti in presenza di acido docosaesaenoico (DHA) e lo studio della loro interazione con membrane lipidiche, allo scopo di comprendere il meccanismo con cui esercitano la loro tossicità . Il DHA è uno dei principali acido grassi cerebrali, strettamente correlato al PD e ad aS. L'esposizione di colture cellulari dopaminergiche a PUFAs porta all'accumulo di oligomeri solubili di aS, responsabili della citotossicità associata alla neurodegenerazione (Assayag et al., 2007). Esistono poi evidenze dell'implicazione di aS nella regolazione del metabolismo degli acidi grassi (Golovko et al., 2007). Inoltre è stato osservato che, nei pazienti affetti da PD, la presenza di DHA è maggiore nelle aree cerebrali contenenti inclusioni di aS. Studi in vivo, infine, hanno dimostrato che il DHA induce la formazione di oligomeri di aS (Sharon et al., 2003). In precedenti studi condotti nel laboratorio dove è stata svolta questa Tesi è stato analizzato il processo di aggregazione di aS in presenza di DHA, utilizzando due diversi rapporti molari proteina/acido grasso) (De Franceschi et al., 2009) e gli aggregati proteici ottenuti in queste condizioni sono stati caratterizzati da un punto di vista morfologico e strutturale (De Franceschi et al., 2011). E' stato osservato che la presenza di DHA in rapporto molare 50:1 rispetto alla proteina, porta alla formazione di oligomeri stabili, off-pathway nel processo di fibrillazione, che presentano una significativa attività tossica sulle cellule rispetto al monomero di aS. Nella prima parte di questa ricerca è stata condotta una caratterizzazione di queste specie oligomeriche che sono sufficientemente stabili nel tempo da consentire l'uso di diverse tecniche biofisiche. In particolare gli oligomeri sono stati analizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e a forza atomica (AFM), per studiare le dimensioni e la morfologia. Il tipo di struttura secondaria è stata valutata mediante dicroismo circolare che ha dimostrato un'altra peculiarità di questi oligomeri, ovvero la presenza di struttura parzialmente in α-elica, diversamente dalla maggior parte degli oligomeri descritti in letteratura. E' stata analizzata anche la capacità degli oligomeri di interagire con le membrane, utilizzando liposomi di diversa dimensione e diversa composizione e colture cellulari. L'interazione tra gli oligomeri e i liposomi, studiata mediante CD e saggi di leakage, causa il rilascio di piccole molecole interne alle vescicole, dimostrando così un loro effetto destabilizzante sulle membrane. L'attività degli oligomeri è stata anche testata su cellule in coltura che mostrano un'alterata permeabilità in loro presenza. Per determinare quale sia il meccanismo di destabilizzazione degli oligomeri, sono stati eseguiti vari saggi. Si è dimostrato tramite dynamic light scattering (DLS) e TEM che le vescicole, in seguito al legame con gli oligomeri, non vengono distrutte. Inoltre mediante studi di aggregazione e analisi su planar lipid membrane portano a ipotizzare un meccanismo di tossicità dovuto alla formazione di un'apertura transiente o un aumento di flip-flop a livello delle membrane. I risultati di questa parte di tesi sono oggetto di una pubblicazione (Fecchio et al., 2013). Un altro aspetto che è stato approfondito in questo lavoro di Tesi è lo studio degli oligomeri da un punto di vista chimico, allo scopo di caratterizzare le modifiche chimiche presenti sulla sequenza della proteina in seguito all'esposizione al DHA. Sono state evidenziate diverse modifiche mediante spettrometria di massa tra cui carbonilazioni e presenza di addotti. Quest'ultimo tipo di modifica in particolare avviene a livello dell'istidina in posizione 50. Per approfondire il ruolo di questo aminoacido nell'interazione con gli acidi grassi è stato studiato il mutante H50Q di aS. Questa proteina modificata è tra l'altro responsabile di forme familiari del PD. Infine è stata studiata anche l'interazione di altre varianti patologiche di aS associate a PD, A30P, E46K e A53T con DHA. In particolare, è stata analizzata la loro struttura e la loro tendenza ad aggregare in presenza di DHA, nonchè la loro capacità di formare oligomeri, in confronto ai risultati ottenuti con aS. In conclusione questo studio ha permesso di fornire maggiori informazioni sulla struttura e di studiare l'attività di specie oligomeriche che sono potenzialmente molto rilevanti per la patogenesi del PD. La struttura e l'attività di questi oligomeri potrà essere confrontata con quelle di oligomeri prodotti in diverse condizioni sperimentali o di oligomeri prodotti da altre proteine amiloidogeniche. Questa conoscenza è fondamentale per sviluppare agenti terapeutici che prevengano o debellino queste malattie debilitanti ed in continuo aumento