Set up of different strategies to selectively target Glioblastoma Cells

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor in adults, displaying fast growth, vascular proliferation, diffuse infiltrative nature into the brain parenchyma and necrosis areas. Despite optimal multimodal therapeutical treatment including surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy, the prognosis of patients remains still dismal, with a median survival of 14 months. One hypothesis seems to be related to the existence in the brain of the Cancer Stem Cells (CSCs). These cells are so-called Glioma Stem Cells (GSCs) and are described as a sub population of undifferentiated tumor-cells with stem-like properties, self-renewal, multi-lineage differentiation ability, maintained proliferation and highly tumorigenic potential in immune-deficient mice. GSCs seem to be play a key role in GBM initiation and progression, contributing to chemotherapy and radiotherapy resistance and tumor recurrence. Therefore, there is an urgent need to develop novel therapeutic approaches, to selectively target GSCs. In this study, we focus on two different therapeutical approaches: - the use of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) as delivery vehicles for brain tumor therapy, exploiting their inherent tumor-tropism probably related to the effect of cytokines and chemokines, secreted by infiltrated tissues. - Virotherapy, employing the R3616 as neuroattenuated Herpes Simplex Virus type1. R3616 is a HSV1 mutant deleted for both copies of the gene γ34.5, important for viral replication and neurovirulence. The effect of these deletions inhibits autophagy, blocks virus-induced host protein shutoff, and attenuate virus replication in GSCs, minimizing neurotoxicity. GSCs employed for this study have been isolated from GBM specimens obtained during surgical procedures of tumor removal and cultured in adhesion under normoxic and hypoxic conditions or in suspension as neurospheres under normoxic conditions. Neuropheres were phenotypically characterized for some of stemness markers, such as CD133, Nestin, Sox2 and CD44. In order to choose the best cell candidate for cell delivery experiments, we investigated between hMSCs isolated from human bone marrow of healthy donors (BM-MSCs) and glioma patients adipose tissue (AT-MSCs) obtained during GBM surgical resection. hMSCs from both sources were phenotypically characterized and cultured under hypoxic and normoxic conditions in order to mimic the peculiar and heterogeneous GBM microenvironment towards cells would be further delivered. The BM-MSCs retained: a.) faster growth, b.) a greater in vitro multilineage differentiative potential and c.) increased migratory ability than AT-MSCs, especially in hypoxic conditions; thus suggesting to be the most suitable vehicles for our future analyses. Moreover, we evaluated BM-MSCs tropism to GBM derived cells modulated by oxygen levels or by the presence and absence of soluble factors shown to be able to stimulate astro-glial and neuronal differentiation, such as BMP2 and WNT3a respectively. Indeed, BMPs are members of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamily shown to stimulate both proliferation and mitotic arrest, to promote astro-glial differentiation reducing cell growth and increasing portion of GFAP+ cells. Wnt3a ligand mediates neuronal differentiation and proliferation inhibition of GBM cells and this phenomenon is enhanced under hypoxic conditions. hMSCs tropism was assessed both when primary GBM –derived cells were pre-treated alternatively with BMP2 or WNT3a and when such factors were delivered towards GBM cells. Our data demonstrated pro-differentiating molecules as enhancing agents of hMSCs migratory properties, especially in hypoxia. Experiments involving viruses were performed both on HSV1 wild type and R3616 to test the ability to replicate in and to kill GSCs. As expected for a neuroattenuated virus, R3616 replication in GSCs was widely impaired and the killing ability were decreased compared to the wild type. Both viruses were also employed to test their replication capacity and cytotoxicity in BM-MSCs. Compared to HSV1 wild type, R3616 retained impaired replication efficiency and attenuated killing ability in hMSCs. BM-MSCs inherent tropism was also investigated in GSCs infected with HSV1 wild type or R3616. Interestingly, we found that GSCs R3616 infected significantly increased the migratory properties of BM-MSCs. In conclusion, these findings support the use of BM-MSCs as a promising cell vehicle candidate for tumor-specific delivery and open the way to the development of engineered BMPs-expressing MSCs to further assays in GBM -derived cells. Additionally, the R3616 ability to kill GSCs encourages next efforts to combine both methods to obtain an efficient strategy to selectively target GSCs. Our preliminary data have already demonstrated that co-treatment of R3616 and BMP2 increases the differentiation markers expression. Accordingly, BM-MSCs retained a preferential inherent homing towards more differentiated cells.

Il Gliobalstoma multiforme (GBM) è il più comune e maligno dei tumori cerebrali nell’adulto, caratterizzato da una rapida crescita, proliferazione vascolare e diffusa infiltrazione nel parenchima cerebrale. Nonostante negli ultimi anni siano stati fatti notevoli progressi terapeutici che includono la rimozione chirurgica della massa, seguita da radioterapia e chemioterapia, la prognosi ancora oggi permane particolarmente infausta con una sopravvivenza media di circa 14 mesi dalla diagnosi. Ciò pare sia associato anche all’esistenza nel cervello di una popolazione di cellule definita “Cancer Stem Cells” (CSCs). Tali cellule vengono definite Glioma Stem Cells (GSCs) e, al pari delle normali cellule neuronali staminali, sono caratterizzate da capacità di auto-rinnovamento, sono multipotenti, nonché tumorigeniche in vivo. Inoltre, le GSCs sembrano svolgere un ruolo importante nell’insorgenza e la progressione del GBM, contribuendo appunto alla resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia, oltre ad essere responsabili delle recidive di tale tumore. A fronte di tutto ciò, si rende quindi necessario più che mai lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che siano particolarmente selettive e mirate a colpire la popolazione delle GSCs. In questo lavoro di tesi, abbiamo posto la nostra attenzione in particolare a due strategie: - L’uso delle Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) come sistemi di delivery cellulari per composti attivi contro i tumori cerebrali sfruttando il loro intrinseco tropismo per il letto tumorale per effetto di citochine e chemochine rilasciate dai tessuti infiltrati. - L’utilizzo di un virus oncolitico di tipo herpetico, R3616, ingegnerizzato per colpire selettivamente le cellule tumorali e non causare neurovirulenza, essendo stato deleto dei geni γ34.5 responsabili dell’insorgenza di encefalite. L’effetto di queste delezioni inoltre comporta inibita autofagia e attenuata replicazione anche nelle stesse GSCs. Le GSCs utilizzate per i nostri esperimenti sono state derivate da biopsie di pazienti affetti da GBM e coltivate in adesione al 21% che al 2% di O2 o in sospensione al 21% di O2 come neurosfere secondo i parametri previsti da protocolli accettati in letteratura. Le cellule cresciute come neurosfere sono state caratterizzate fenotipicamente con alcuni dei più comuni marcatori di staminalità, tra cui il CD133, la Nestina, Sox2 e il CD44. Per gli esperimenti di delivery cellulari sono state inizialmente valutate le hMSCs isolate dai campioni di midollo osseo derivanti da donatori sani (BM-MSCs) e da tessuto adiposo (AT-MSCs) cerebrale prelevato durante l’intervento di rimozione chirurgica di GBM dello stesso paziente. Le MSCs appartenenti ad entrambe le fonti sono state immuno-fenotipicamente caratterizzate e coltivate in ipossia e in normossia al fine di valutarne la capacità e l’efficienza di crescita ricreando il tipico microambiente del GBM verso cui poi le cellule dovrebbero essere fatte migrare. Saggi a.) di crescita, b.) di differenziamento in vitro e c.) di migrazione hanno evidenziato come le BM-MSCs migrino in maniera più efficiente e selettiva delle AT-MSCs verso le cellule tumorali, specie in condizioni ipossiche. Pertanto, le BM-MSCs sono state scelte come modello di delivery cellulare per proseguire i nostri esperimenti. Inoltre abbiamo visto come questa migrazione avvenga anche verso cellule tumorali pre-trattate con fattori morfogeni ad effetto pro-differenziativo nei gliomi, quali BMP2 e WNT3a. Le BMPs sono membri della Famiglia del Transforming Growth Factor-β (TGF-β), e sono in grado a livello cerebrale di portare ad arresto del flusso mitotico, blocco della proliferazione cellulare e ad un’azione di differenziamento in senso gliale aumentando la percentuale di cellule a fenotipo GFAP+. Il Wnt3a è noto essere invece un ligando in grado di promuovere il differenziamento in senso neuronale e inibire la proliferazione cellulare, specie in ipossia. Per gli esperimenti di Virotherapy si è innanzitutto valutata la capacità di replicazione e di morte cellulare del virus deleto R3616 paragonandola all’ efficienza dell’HSV1 wild type nelle GSCs. R3616 ha dimostrato un’efficienza di replicazione e di uccisione attenuata rispetto all’HSV1 wild type. Entrambi i virus sono stati poi testati per valutare la capacità di replicazione e di killing nelle BM-MSCs. Rispetto all’ HSV1 wild type, R3616 ha riportato una minore citotossicità e compromessa capacità di replicazione. L’efficienza di migrazione delle BM-MSCs è stata poi valutata in GSCs infettate sia con HSV1 wt, sia con R3616. In entrambi i casi è trovato un aumentato tropismo delle BM-MSCs, specie quando le GSCs erano state infettate con R3616. In conclusione in questo lavoro, proponiamo l’utilizzo di cellule staminali mesenchimali come veicolo per trattare il Glioblastoma con molecole fisiologiche ad azione pro-differenziativa così da aumentarne la risposta agli attuali trattamenti chemioterapici. Inoltre, l’aumentata efficienza di migrazione insieme alla capacità di uccisione selettiva delle GSCs riscontrata nell’utilizzo di R3616, incoraggiano a un trattamento di combinazione dei due possibili approcci. Risultati preliminari hanno già evidenziato come GSCs infettate con R3616 e trattate con BMP2 siano in grado di aumentare l’espressione dei canonici marcatori di differenziamento cellulare e ciò incoraggia a valutare se tale effetto possa stimolare ulteriormente l’efficienza e aumentare la selettività di migrazione delle BM-MSCs.