Identification of functional miRNA interactions in Malignant Melanoma progression

According to the World Health Organization (WHO), Malignant Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Melanoma accounts for only about 4% of skin cancer cases but for as many as 74% of all deaths caused by skin cancers. The development of regional and/or distant metastases and the lack of promising therapies for the treatment of Melanoma are the principal causes of extremely poor survival of Melanoma patients. Recently, enormous efforts are taken to unravel the molecular mechanisms that lead to tumour development and metastasis. A new class of small non-coding RNAs, the microRNAs (miRNAs), has been involved in tumour progression and metastasis. MiRNAs are able to modulate the expression of specific target genes binding to their 3’-UTRs through Ago proteins complex and usually causing transcript degradation. The ability of miRNAs to achieve simultaneous fine-tuning of numerous different targets makes them a fundamental system for cell regulation but, despite their biological importance, the identification of their targets is still a challenging research task. The aim of my project is the identification of real functional miRNA-target interactions involved in pathways that control Melanoma metastasis. The experiments were performed using the metastasis model developed by Xu and colleagues (Xu et al., 2008) composed by a low metastatic Melanoma cell line (LMCs), its derivative high metastatic cell lines (HMCs) and the lung metastases (Mets) arisen after these cell lines are injected into immunodeficient mice. This model mimics the behaviour of cancer cells during metastasis progression. To reach proposed aims, I have set up a meta-analysis approach first and a genome wide biochemical approach later. The combination of the two approaches have been allowed the experimental validation of results obtained by meta-analysis and the identification of new miRNA interactors. I first performed miRNA microarray experiments on LMCs, HMCs and Mets samples observing that miRNA expression profiles are able to distinguish the three different grade of metastasis. Since the evidence of miRNAs involvement in metastasi, I used a meta-analysis approach to evidence the influence of miRNA in pathways involved in the extravasation processes: WNT signalling pathway, Adherens Junction pathway, and VEGF signalling pathway. Moreover, I identified important miRNA clusters (e.g. miR-106a~363 cluster) involved in the regulation of metastatic hallmarks such as the cell protrusion formation, cell-cell signaling, and the tissue vascularization. In order to validate all the interactions identified by meta-analysis, I set up conditions for the simultaneous experimental identification of miRNA-target interactions through the high-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation (HiTS-CLiP). This method uses ultraviolet irradiation to covalently crosslink RNA–protein complexes, in our case Ago proteins, that are in direct contact (approximately over single ängstrom distances) within cells. Through the immunoprecipitation complexes are purified allowing the identification of interacting RNA through high-throughput sequencing methods. This technique validated several miRNA-mRNA interactions identified by meta-analysis and by literature. In particular, has been observed the involvement of miR-106a in Adherens junction and VEGF signaling pathways where seems to act as metastasis suppressor inhibiting pro-metastatic genes as WAVE3 and VEGFA. Moreover, sequencing analyses have confirmed the metastatic powerful for miR-214 and let-7c in Melanoma metastasis. The importance of miR-214 was confirmed by results obtained by our collaborator Dr. Taverna of University of Torino, while I used let-7c inhibition to confirm that it interacts with two targets (FNDC3B and FOXN) identified by AGO-Hits-CLIP experiment and that can be studied in future functional studies. Finally, I have also discussed the involvement of a new class of miRNA regulators: the long non-coding RNAs (lncRNAs). I identified a lot of lncRNAs with the ability to regulate miRNA availability. Taken together, these findings demonstrate the strong involvement of miRNAs in metastasis. In fact, several functional miRNA-transcript interactions could regulate extravasation pathways during the Melanoma cells spreading. My experimental approach successfully guides us towards important biological results with interesting therapeutic implications in Melanoma.

Il Melanoma è una delle forme più aggressive di tumore cutaneo. Pur rappresentando soltanto il 4% dei tumori della pelle causa quasi il 74% dei decessi dei pazienti che presentano neoplasie cutanee. Lo sviluppo di metastasi e la mancanza di terapie efficaci sono la causa di una mortalità così elevata. Recentemente, grazie a metodiche di medicina molecolare, i ricercatori hanno cercato di capire i meccanismi che portano allo sviluppo della massa tumorale e delle metastasi individuando nei microRNA (miRNA) dei possibili regolatori coinvolti nella progressione tumorale del Melanoma. Questi corti trascritti non codificanti hanno la capacità di regolare l’espressione di molti mRNA degradandoli o bloccandone la traduzione. Il processo di regolazione guidato dai miRNA è basato sul legame degli stessi a specifiche sequenze presenti nei trascritti target grazie all’ausilio di un complesso proteico formato prevalentemente dalle proteine della famiglia Argonaute (AGO). Lo scopo di questa tesi è di identificare queste interazioni miRNA-mRNA coinvolte nelle vie di segnale che controllano lo sviluppo di metastasi nel Melanoma. Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati effettuati sfruttando un modello cellulare che mima lo sviluppo metastatico (Xu et al., 2008). Il sistema vede l’utilizzo di una linea cellulare a basso potenziale metastatico (LMC), delle linee cellulari derivate dalla stessa ma con maggiore potenziale metastatico (HMC) e delle metastasi polmonari originate dall’iniezione di queste linee cellulari in topi immuno-deficienti. Per raggiungere lo scopo di questa tesi ho messo a punto due approcci che mirano al raggiungimento del medesimo risultato permettendo così anche di validare gli stessi. Il primo approccio, prettamente di tipo bioinformatico, sfrutta i dati di espressione dei miRNA e degli mRNA ottenuti da esperimenti di microarray per individuare le coppie miRNA-mRNA coinvolte nello sviluppo del Melanoma. Il secondo approccio, invece, si basa su una nuova metodica (AGO-Hits-CLIP) per l’identificazione genome-wide di interazioni miRNA-mRNA. Questa metodica sfrutta l’immunoprecipitazione delle proteine AGO e il recupero delle molecole di RNA ad esse associate (in questo caso i miRNA e i messaggeri bersaglio a cui erano legati). Successivamente, l’RNA precipitato viene sequenziato per permetterne l’identificazione. L’integrazione dei dati ottenuti dall’analisi con i microarray (meta-analisi) e dall’AGO-Hits-CLIP mi hanno permesso di individuare delle interazioni miRNA-bersaglio coinvolte nello sviluppo di metastasi generate dal Melanoma. Innanzitutto mi ha permesso di individuare una serie di vie di segnale strettamente correlate all’extravasazione delle cellule dal torrente circolatorio. Queste vie sono probabilmente regolate da alcuni membri di un cluster policistronico di miRNA: il miR-106a~363. In particolare grazie alla metodica AGO-Hits-CLIP ho validato due interazioni del miR-106; una con il trascritto WAVE3 e l’altra con VEGFA. Questi sono rispettivamente coinvolti nella formazione delle protrusioni che la cellula utilizza per invadere i tessuti (l’invadopodium) e nella permeabilizzazione della parete dei vasi sanguigni,. Inoltre è stata confermata l’importanza del miR-214 e di let-7c nello sviluppo metastatico. L’effetto di miR-214 è stato confermato anche dagli studi di una nostra collaboratrice, la Professoressa Daniela Taverna dell’Università di Torino mentre per let-7c ho validato due interattori (FNDC3B e FOXN) identificati mediante la metodica AGO-Hits-CLIP. Oltre alla relazione miRNA:mRNA, la tecnica AGO-Hits-CLIP ha permesso di evidenziare una nuova classe di interattori: i lncRNA. Questi sono dei trascritti non codificanti lunghi più di 200 nt che sembrano funzionare da “spugna” per i microRNA, sequestrandoli e impedendone la loro funzione regolativa. Concludendo, i risultati ottenuti sostengono l’importanza dei miRNA nello sviluppo del Melanoma e nella sua metastatizzazione evidenziandone il ruolo cardine per un futuro sviluppo di nuovi farmaci che consentano la riduzione del rischio di sviluppare metastasi e, di conseguenza, di diminuire l’alta mortalità.