Studio della modulazione dell'espressione genica mediata dai microRNA in cellule infettate da citomegalovirus umano

Background: The activity of only few human cytomegalovirus (HCMV) microRNAs (miRNAs) has been investigated so far and mainly involved in viral life cycle and evasion from host immune response. Aim of this study was to characterize the effects of HCMV infection and miRNAs on host human miRNA and mRNA expression profiles after infection; and the identification and validation of the cellular targets of HCMV miRNAs. Methods: Microarray analysis of miRNA and mRNA temporal expression was done in time series, 4, 8, 24, 48,and 72 h.p.i. on MRC 5 cells infected with HCMV Towne strain. Differentially expressed mRNAs and miRNA both cellular and viral, were selected according to the area of the region bounded by the expression profiles related to control and post infection cases. Identification of HCMV miRNAs targets was done by sequence based prediction algorithms and expression based correlation; validation of hcmv-miR-US25-2-3p and hcmv-miR-US25-2-5p targets was performed by luciferase activity assays and western blot analysis. The effects of hcmv- miR-US25-2-3p on PTBP1-dependent alternative splicing was studied by Real time RT-PCR. The positive effect of hcmv-miR-US25-2-3p on HCMV replication was verified in a hcmv- miR-US25-2-3p knock out model. Results: The majority of HCMV miRNAs was found to be expressed since the earliest stages or within 24 hours post infection, in particular hcmv-miR US25-2-3p was one of the most expressed since 4 hours post infection and continued to accumulate over time. Expression of cellular miRNAs during HCMV infection revealed 68 cellular miRNAs differentially expressed post infection that were grouped, by clustering analysis, into 6 clusters of cellular miRNAs, involved in proliferation and cell differentiation and characterized by coherent changes in expression profile during the time course of infection. Sequence-based predicted hcmv-miR-US25-2-3p targets PTBP1, HDAC11, HDAC4 and IFI30 were significantly inhibited by the miRNA both in luciferase activity assay and in western blot; while expression based correlated target of hcmv-miR-US25-2-5p target gene CD68 and Fas were not confirmed by luciferase activity assay and western blot. Hcmv-miR-US25-2-3p inhibition of host transcripts PTBP1-dependent alternative splicing was demonstrated. Finally hcmv-miR-US25-2-3p knock-down decreases HCMV replication. Conclusion: An integrated analysis of viral and cellular miRNAs and host mRNA and the identification of new targets genes for hcmv-miR-US25-2-3p involved in the epigenetic regulation of viral and host gene expression and in innate immune response allowed a further understanding of the complex interaction between HCMV and the host cell during infection.

Introduzione: Ad oggi l’attività di pochi microRNA (miRNA) di citomegalovirus umano (HCMV) è stata studiata, e correlata con il ciclo re plicativo virale e con l’evasione della risposta immunitaria. Scopo di questo studio è stata la caratterizzazione degli effetti dell’infezione e dei miRNA di HCMV sull’espressione dei miRNA e dell’ mRNA umani della cellula ospite dopo l’infezione,e l’dentificazione e validazione dei target cellulari dei miRNA diHCMV. Metodi: É stata effettuata un’analisi mediante microarray per valutare la cinetica di espressione temporale 4, 8, 24, 48, 72 h.p.i. dei miRNA virali e cellulari, e dell’mRNA cellulare in un esperimento di infezione di cellule MRC-5 infettate con il ceppo Towne HCMV ad una MOI 2. mRNA e miRNA, cellulari e virali, differenzialmente espressi, sono stati selezionati secondo l' area della regione delimitata dai profili di espressione relativi al controllo e i casi post infezione. L’identificazione dei target dei miRNA di HCMV è stata fatta mediante un algoritmo di predizione computazionale, basato sulla complementarietà di sequenze, e la correlazione dell’espressione dell’mRNA con l’espressione dei miRNA; la validazione dei target dei miRNA hcmv-miR-US25-2-3p e hcmv-miR-US25-2-5p è stata effettuata mediante saggi di luciferasi e western blot. Gli effetti di hcmv-miR-US25-2-3p sullo splicing alternativo PTBP1-dipendente sono stati studiati mediante real-time RT-PCR . L'effetto positivo di hcmv-miR-US25-2-3p sulla replicazione di HCMV è stato verificato in un modello knock- out per hcmv- miR-US25-2-3p. Risultati: La maggior parte dei miRNA di HCMV è espressa fin dai primi stadi o entro 24 ore dopo l'infezione, in particolare, hcmv-miR-US25-2-3p è uno dei più espressi a partire da 4 ore dopo l' infezione e continua ad accumularsi nel tempo. L’espressione dei miRNA cellulari durante l'infezione da HCMV ha rivelato 68 miRNA cellulari differenzialmente espressi dopo l'infezione che sono stati raggruppati, con analisi di clustering, in 6 cluster di miRNA cellulari, coinvolti nella proliferazione e differenziazione cellulare e caratterizzati da cambiamenti coerenti nel profilo di espressione durante il decorso dell'infezione. I target predetti sulla base della complementarietà di sequenza di hcmv-miR-US25-2-3P PTBP1 , HDAC11 , HDAC4 e IFI30, sono significativamente inibiti dal miRNA sia nel saggio di attività della luciferasi che in Western Blot, mentre i target individuati mediante la correlazione di espressione di hcmv-miR-US25-2-5p, CD68 e Fas, non sono stati confermati da test di attività della luciferasi e dall’analisi dell’espresione proteica mediante Western Blot. È stata dimostrata l’inibizione di hcmv-miR-US25-2-3p sullo splicing alternativo PTBP1-dipendente dei trascritti della cellula ospite. Infine, il knock-down di hcmv-miR-US25-2-3p diminuisce la replicazione di HCMV. Conclusione: Un'analisi integrata dei miRNA virali e cellulari e dell’ mRNA della cellula ospite, e l'identificazione di nuovi geni target per hcmv-miR-US25-2-3p coinvolti nella regolazione epigenetica dell'espressione genica virale e cellulare e nella risposta immunitaria innata ha permesso una maggiore comprensione della complessa interazione tra HCMV e cellula ospite nel corso di infezione.