The role of deoxynucleotide trafficking and degradation in the maintenance of balanced pools of DNA precursors in mammalian cells

Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) are the precursors for DNA synthesis. Their balanced concentrations ensure the accuracy of nuclear and mitochondrial DNA replication and of DNA repair. dNTP pool sizes and relative proportions are regulated by a network of anabolic and catabolic enzymes, operating in the cytosol and in mitochondria. Cytosolic and mitochondrial pools are separated by the impermeable inner mitochondrial membrane but multiple evidences suggest the existence of mitochondrial carriers mediating the transport of deoxynucleotides between the two compartments. PNC1 has been identified as a pyrimidine nucleotide carrier by reconstitution in liposomes and its involvement in the import of UTP into mitochondria has been confirmed in human cells. The main enzyme synthesizing dNTPs is the cytosolic ribonucleotide reductase (RNR). It provides the four DNA precursors in balanced amounts through a tight regulatory mechanism based on two distinct allosteric sites controlling catalytic activity and substrate specificity. Alternatively, dNTPs derive from the salvage of deoxynucleosides by subsequent phosphorylation steps in the cytosol and in mitochondria. Catabolic enzymes mediate the dephosphorylation of deoxynucleoside monophosphates and the degradation of deoxynucleosides. SAMHD1 is a recently identified catabolic enzyme with a dNTP triphosphohydrolase activity and is allosterically activated by dGTP to degrade the four dNTPs. It was first described as a restriction factor for HIV-1 infection in immune cells but its wide expression in most human tissues suggests that it may have a more general function. The present work investigates the role of deoxynucleotide trafficking and degradation on the maintenance of dNTP pool balance focusing on three major issues: (i) the role of PNC1 in the trafficking of thymidine nucleotides in intact cells, (ii) the mechanism of allosteric regulation of SAMHD1 and (iii) its biological function in human cells. We demonstrate that PNC1 is involved in the import of thymidine phosphates into mitochondria and in their export to the cytosol. Thymidine nucleotides are mostly synthesized de novo and by TK1-dependent salvage in the cytosol when cells are replicating their nuclear DNA, while the mitochondrial salvage of thymidine prevails outside S-phase. Thus, the bidirectional transport of thymidine nucleotides across the inner mitochondrial membrane maintains the intracellular equilibrium of the dTTP pool. In human cells we find that SAMHD1 expression is cell-cycle regulated, highest in quiescence and minimal in S-phase. Manipulation of its expression through siRNAs disrupts the cell-cycle regulation of dNTP pools, which are present at low levels outside S-phase and expand in S to support the replication of the nuclear genome. Disregulation of dNTP pools disturbs the normal progression of the cell cycle by interfering with the G1/S transition. We describe a key role for SAMHD1 and its catabolic activity in maintaining DNA precursors at low concentrations in the G1-phase to allow a correct transition into S. Through a biochemical characterization of the recombinant mouse and human proteins we demonstrate the existence of two distinct regulatory sites for the control of SAMHD1 activity. We suggest that a common regulatory mechanism based on allostery operates on the two opposed reactions catalyzed by RNR and SAMHD1 to set dNTP pool balance.

I deossinucleosidi trifosfato (dNTPs) sono i precursori della sintesi del DNA. Le loro concentrazioni devono essere bilanciate affinchè la replicazione del DNA nucleare e mitocondriale e la riparazione del DNA siano accurate. Le dimensioni dei pool e le loro proporzioni sono regolate da una rete di enzimi anabolici e catabolici che operano nel citosol e nei mitocondri. I pool citosolico e mitocondriale sono separati dalla membrana mitocondriale interna che costituisce una barriera impermeabile, ma molte sono le evidenze dell'esistenza di trasportatori mitocondriali per lo scambio di deossinucleotidi tra i due compartimenti. PNC1 è stato identificato come un trasportatore di nucleotidi pirimidinici dopo essere stato ricostituito in liposomi; il suo ruolo nell'importo di UTP nei mitocondri è stato confermato in cellule umane. L'enzima principale per la sintesi dei dNTPs è la ribonucleotide reduttasi (RNR) nel citosol. L'enzima produce i quattro precursori del DNA in quantità bilanciate attraverso un meccanismo di regolazione allosterico basato su due siti distinti che controllano l'attività catalitica e la specificità di substrato. I dNTPs possono essere sintetizzati anche attraverso la via di recupero che consiste nella fosforilazione di deossinucleosidi nel citosol e nei mitocondri. Gli enzimi catabolici degradano i deossinucleosidi monofosfato e i deossinucleosidi. SAMHD1 è un enzima catabolico scoperto recentemente; è una dNTP trifosfoidrolasi ed è in grado di degradare i quattro dNTPs se attivato in maniera allosterica dal dGTP. E' stato recentemente identificato come il fattore di restrizione di HIV-1 nelle cellule del sistema immunitario, ma il fatto che sia ampiamente espresso in molti tessuti umani suggerisce che svolga una funzione più generale. In questo lavoro abbiamo affrontato tre questioni principali: (i) il ruolo di PNC1 nel trasporto di nucleotidi della timidina, (ii) il meccanismo di regolazione allosterica di SAMHD1 e (iii) il suo ruolo nelle cellule umane. Dimostriamo che PNC1 media l'importo dei fosfati della timidina nei mitocondri e contemporaneamente il loro esporto verso il citosol, allo scopo di mantenere l'equilibrio dei pool citosolico e mitocondriale del dTTP. In cellule umane dimostriamo che l'espressione di SAMHD1 è regolata nel corso del ciclo cellulare, con un livello massimo al di fuori della fase S e un livello minimo nella fase di sintesi del DNA. Il suo ruolo è quello di mantere i pool dei dNTPs a basse concentrazioni in fase G1 per consentire l'entrata in S e la corretta progressione del ciclo cellulare. Attraverso la caratterizzazione biochimica della proteina, dimostriamo che la sua attività enzimatica è regolata in maniera complessa da due siti allosterici distinti. Proponiamo che un meccanismo di regolazione comune basato su proprietà allosteriche operi sulle due reazioni opposte catalizzate da RNR e SAMHD1 per determinare un pool bilanciato di precursori.