Effects of egg enrichment with glucocorticoid hormone, antagonist and receptor messenger in the modulation of gene expression in zebrafish (Danio rerio) embryos with transgenerational follow up till adulthood

This study is relevant to the recent field of investigation on the genetic programming of embryo development by maternal glucocorticoid and its receptor messenger with lasting influences on subsequent life stages. This research has been undertaken with an articulate experimental design supported by an ample repertoire of biomolecular techniques, ranging from whole-genome microarray to relative and absolute qPCRs of glucocorticoid-dependent up- and down-regulated genes. I have found that cortisol enrichment of newly fertilized eggs by immersion in a solution of the steroid (13:M) for 2 h brings about significant up-regulation of 100 genes with no down-regulation at 5 h post-fertilization (hpf), when only maternal cortisol is available to the embryo. At 12 hpf, 143 genes were up-regulated and 6 down-regulated with only 30 genes in common with those at 5 hpf, indicating that substantial changes in responsiveness to maternal cortisol may occur at early developmental phases. At 24 hpf, responsiveness to cortisol was enlarged to hundreds of genes. Subsequently, I analyzed by relative qPCR seven target genes during development, observing a significant decrement of expression from 10 to 24 hpf of both vasp and plp1a genes, when ef1α was used as a calibration reference. Moreover, four genes that were up-regulated at 5 hpf (mat1a, notch2, parn and stmn2a), were no longer so at 20 hpf. The work has been extended to the analysis of cortisol-induced changes in the expression of two target genes, igf-2a and casp8. It was demonstrated that the expression of igf-2a was significantly enhanced by egg microinjection with the zebrafish glucocorticoid receptor mRNA (z-gr mRNA), and more so by z-gr mRNA plus cortisol at 5 hpf and, to a lesser extent, at 10 hpf. This is of interest since igf-2a is considered as a major growth factor during embryogenesis. A stimulatory response was obtained also with casp8 at 5 hpf with both treatments, with a non-significant decrement at 10 hpf. Using absolute qPCR, I confirmed an expression enhancement of casp8 transcription by z-gr mRNA w/wo cortisol at 5 hpf, which was depressed by both the glucocorticoid antagonist RU486 and the z-gr mRNA translation knockdown by morpholino. Surprisingly, at 10 hpf, the latter negative modulations were reversed. The complexity of glucocorticoid action on embryonic gene expression was highlighted also by absolute qPCR of another gene, mcm6, whose transcripts were significantly increased by both cortisol and RU486 when administered alone, but decreased when in combination with z-gr mRNA at both 5 and 10 hpf. Further, I examined in details the effects of the above treatments on larval survival after hatching (3 days pf) and undertook a study on the influence of cortisol enrichment of fertilized eggs on fish growth till 180 days of age by comparing a lineage in which the treatment was repeated along four generations (F1-F4) with another lineage acting as an untreated control. Since both lineages were homozygous for different colour patterns, they could be co-cultured, thus eliminating any differential environmental influence. This experiment was intended to determine whether exposure of early embryos to cortisol exerts a permanent imprinting on subsequent body growth and to elucidate the transgenerational pattern of this epigenetic modulation. Through statistical analysis, I established greater growth in cortisol-treated F1 and F2 from 120 to 180 dpf in terms of length and body weight. But, in F3 and F4, the difference in length disappeared, while that in body weight was somehow reversed. This seems to suggest that the priming effect was compensated rather than intensified along generations, as if a sort of adaptation has occurred.

Questo studio è rilevante dal momento che recenti ricerche si sono concentrate sul ruolo svolto dai glucocorticoidi di origine materna e dai messaggeri codificanti per il loro recettore nella programmazione genetica dello sviluppo embrionale, con particolare attenzione alle fasi di vita successive. Tale ricerca è stata effettuata seguendo un articolato disegno sperimentale supportato dall’utilizzo di molteplici tecniche biomolecolari, quali, ad esempio, il microarray e la real time PCR sia relativa che assoluta. E’stato dimostrato che l’arricchimento delle uova di zebrafish appena fecondate con cortisolo, mediante immersione per 2 ore in una soluzione 13:M dello steroide, provoca una significativa up-regolazione di 100 geni a 5 ore dopo la fecondazione (hpf), quando nell’embrione è presente solo il cortisolo di origine materna. Nessun gene è risultato invece down-regolato allo stesso stadio di sviluppo. A 12 hpf, 143 geni sono risultati up-regolati e 6 down-regolati, con solo 30 geni in comune con l’esperimento delle 5 hpf: questo indica che probabilmente nelle fasi precoci di sviluppo embrionale avvengono dei cambiamenti sostanziali nella risposta al cortisolo materno. A 24 hpf la risposta al cortisolo interessa centinaia di geni. Successivamente ho analizzato mediante real time PCR relativa sette geni bersaglio dei glucocorticoidi durante lo sviluppo, osservando una significativa diminuzione dell’espressione dalle 10 alle 24 hpf dei geni vasp e plp1a, con ef1α come “gene housekeeping”. Inoltre ho dimostrato che quattro geni, precedentemente risultati up-regolati a 5 hpf (mat1a, notch2, parn e stmn2a), non risultano più sovraespressi a 20 hpf. Successivamente ho esteso l’analisi anche ai cambiamenti indotti dal cortisolo sull’espressione dei geni target igf-2a e casp8. In particolare ho potuto dimostrare che l’espressione di igf-2a aumenta significativamente in seguito alla microiniezione delle uova con il messaggero codificante per il recettore dei glucocorticoidi di zebrafish (z-gr mRNA), e più ancora se alla microiniezione viene abbinato il trattamento con cortisolo. Questo è stato dimostrato a 5 hpf e, in misura minore, anche a 10 hpf. Questo dato è interessante dal momento che igf-2a viene considerato il principale fattore di crescita durante l’embriogenesi. Un aumento di espressione è stato ottenuto anche per il gene casp8 con entrambi i trattamenti a 5 hpf, mentre a 10 hpf c’è una diminuzione di espressione non significativa. Mediante real time PCR assoluta ho confermato l’aumento di trascrizione del gene casp8 a 5 hpf successivamente alla microiniezione con z-gr mRNA, indipendentemente dall’aggiunta di cortisolo; una diminuzione di espressione è stata invece ottenuta sia con l’utilizzo dell’antagonista dei glucocorticoidi RU486, sia dopo silenziamento del recettore tramite microiniezione con morfolino. Sorprendentemente, a 10 hpf, le modulazioni che erano risultate precedentemente negative hanno avuto un’inversione di tendenza. La complessità dell’azione dei glucocorticoidi sull’espressione genica durante lo sviluppo embrionale è stata messa in evidenza anche dall’esperimento di real time PCR assoluta per il gene mcm6, i cui trascritti sono risultati notevolmente aumentati sia dopo trattamento con cortisolo che con RU486, quando questi reagenti sono stati utilizzati da soli; una diminuzione dei trascritti è stata invece osservata per entrambi i reagenti, sia a 5 hpf che a 10 hpf, quando sono stati impiegati contemporaneamente alla microiniezione con z-gr mRNA. Ho poi esaminato in dettaglio gli effetti di tutti i trattamenti descritti precedentemente sulla sopravvivenza delle larve dopo la schiusa (3 giorni pf) ed ho condotto uno studio sull’influenza dell’arricchimento con cortisolo sulla crescita dello zebrafish, effettuando misurazioni ad intervalli di tempo definiti, fino ai 180 giorni pf. L’analisi è stata fatta comparando una linea in cui il trattamento con cortisolo è stato ripetuto per quattro generazioni successive (F1- F4) con un’altra utilizzata come controllo non trattato. Poichè entrambe le linee erano omozigoti per differenti pattern di colorazione si è potuto anche allevarle assieme, eliminando ogni possibile influenza ambientale. Lo scopo dell’esperimento era determinare se l’esposizione dell’embrione al cortisolo, a stadi di sviluppo precoci, esercitasse un’influenza permanente sulla crescita ed inoltre spiegare il pattern transgenerazionale di tale modulazione epigenetica. Attraverso analisi statistica ho dimostrato che c’è una maggiore crescita nei trattati con cortisolo delle generazioni F1 e F2 dai 120 ai 180 giorni pf in termini di lunghezza e peso corporeo. Nelle generazioni F3 e F4 scompaiono le differenze di lunghezza rispetto ai controlli, mentre il peso corporeo risulta addirittura diminuito. Questi risultati sembrano suggerire che l’effetto iniziale del trattamento viene compensato, e non intensificato, nel corso delle generazioni, come se avvenisse una sorta di adattamento.