analisi del contributo delle poliproteine GAG e POL nello sviluppo della resistenza in pazienti HIV-1 positivi sottoposti a terapia antiretrovirale

The introduction in the mid 1990s of Antiretroviral Therapy in the cure of AIDS has dramatically decreased the morbidity and mortality rate and has significantly extended the lifespan and the quality of life of HIV-1 positive patients. Today there are more than 20 drugs licensed for clinical use, targeting different steps of viral life cycle including viral entry (coreceptor antagonists and fusion inhibitors), reverse transcription (nucleoside, NRTIs, and non-nucleoside inhibitors, NNRTIs, of the viral reverse transcriptase), integration (integrase inhibitors) and viral maturation (protease inhibitors, PIs). Current Guidelines recommend the use of combination therapies, including drugs of almost two classes, in particular one or two NRTIs and one NNRTIs or one PIs, those are considered the standard of care for the treatment of HIV infection. Despite the success of pharmacological combination strategy, the emergence of drug resistance is still a major factor contributing to the therapy failure. The mechanisms of resistance mainly involve mutations directly altering the interaction of viral enzymes and inhibitors (Menéndez-Arias, 2010). Nowadays, most of these mutations, defined drug resistance mutations, are well characterized (Johnson et al., 2010) and are used in standard genotypic tests as predictive clues of treatment failure, but in some cases such limited information is not sufficient to explain the virological failure. Emerging studies reveal that, besides the ones encoding Gag and Pol polyproteins, other regions might contribute to the development of resistance. In particular, some specific cleavage sites and non-cleavage site mutations (Ho et al., 2008; Parry et al., 2009; Dam et al., 2009; Nijhuis et al., 2007), as well as frameshift-regulating site mutations in Gag (Doyon et al., 1998), increase cleavage sites accessibility and polyprotein processing, thus compensating for the catalytic loss of function of the viral Protease (PR) induced by primary resistance mutations. Moreover, some residues in the HIV-1 Reverse Transcriptase (RT) are critical for proteolytic processing of Gag-Pol precursors (Nishitsuji et al., 2011; Chiang et al., 2012). Although the augmenting consciousness of the relevance of other viral protein domains, besides PR and RT enzymes, in the prediction and acquisition of resistance to the antiviral formulations, little is known about the function of such specific mutations in the viral life cycle. Moreover, the available data are not unanimous in defining the relative importance of each analyzed region, for example within the Gag protein (Dam et al., 2009; Parry et al., 2007). In this context, we are interested in studying the functional role of HIV-1 Pr55Gag protein as natural substrates of PR and its contribution in resistance mechanisms. We optimized PCR amplification experimental settings and sequencing conditions of the gag gene from clinical isolates of different subtypes. In collaboration with Professor Parisi, University of Padua, we analyzed the gag sequence derived from clinical samples of HIV-1 infected patients failing PR Inhibitors (PIs) and RT Inhibitors (RTIs), selected among a cohort of five infectious diseases units located in Veneto in Northeastern Italy. In order to determine the contribution of the Pr55Gag protein to the resistance mechanisms and its specific function in the viral life cycle, we designed a cloning strategy that allows to analyze the differential contribution of N-terminal and/or C-terminal regions of Gag in the presence or in the absence of the mutated PR-RT. Indeed, each patient derived PCR products could be inserted in an HIV-1 proviral genome. In particular, we used a modified version of the previously described env-complementation system, in which an env-deleted provirus expresses a reporter gene under the transcriptional control of the viral LTR and it is capable of one single round of replication. The HIV-1 envelope glycoprotein is given in trans along with the Rev protein. Among all the patient samples sequenced so far, we selected one characterized by resistant mutations only in the PR coding region to analyze the effect of the mutated N-terminal region of Pr55Gag protein. Our results indicated that: (i) the patient-derived mutations in the N-terminal region of Pr55Gag enhance the RT activity and the p24 content in the supernatant of producing cells in comparison to the wild type context; (ii) the patient-derived MA/CA cleavage site amino acid sequence doesn’t affect the processing ability of the wild type PR; (iii) the infectivity of virions carrying the patient-derived N-terminal region of Pr55Gag is reduced. Our results would contribute to better characterize the role of Gag and the relations with PR and RT in resistance development, their relevance in viral replication and evolution in the presence or in the absence of drugs

L’introduzione della Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) a metà degli anni Novanta per la cura dell’AIDS ha fortemente ridotto la morbosità e la mortalità ad essa associate e sensibilmente esteso l’aspettativa e la qualità della vita dei pazienti HIV-1 positivi. Attualmente sono più di 20 gli inibitori approvati per l’uso clinico e sono in grado di agire negativamente in diverse fasi del ciclo replicativo virale, quali l’ingresso del virus nella cellula ospite (antagonisti dei corecettori ed inibitori di fusione), la retrotrascrizione (inibitori nucleosidici, NRTIs, e non nucleosidici, NNRTIs, della retrotrascrittasi) e l’integrazione del genoma virale (inibitori dell’integrasi) ed il processo di maturazione della particella virale (inibitori della proteasi, PIs). Le attuali Linee Guida raccomandano strategie terapeutiche che prevedono la combinazione di farmaci appartenenti ad almeno due classi distinte, generalmente due NRTIs in associazione ad un PI o un NNRTI, considerati lo standard of care per il trattamanto dell’infezione da HIV-1. Nonostante il successo dell’approccio combinatorio, il maggior fattore che contribuisce al fallimento terapeutico rimane lo sviluppo di resistenze. La perdita di sensibilità ai farmaci è dovuta principalmente all’insorgenza di mutazioni che alterano il sito di legame degli enzimi virali agli inibitori (Menéndez-Arias, 2010). Attualmente, molte di queste mutazioni, definite mutazioni di resistenza, sono ben caratterizzate (Johnson et al., 2010) e vengono utilizzate nei test genotipici di routine per identificare le cause del fallimento terapeutico, anche se in alcuni casi queste informazioni non sono sufficienti a spiegare il quadro clinico osservato. Studi recenti indicano che, oltre alle sequenze codificanti gli enzimi virali bersaglio della terapia, altre regioni del genoma virale possono contribuire allo sviluppo di resistenze. In particolare, la perdita di attività catalitica della proteasi dovuta alle mutazioni di resistenza può essere compensata da sostituzioni amminoacidiche presenti nelle vicinanze o a livello dei siti di taglio in Gag (Parry et al., 2009; Dam et al., 2009; Nijhuis et al., 2007), così come da sostituzioni a carico del segnale di scorrimento dei ribosomi tra i geni gag e pol (Doyon et al., 1998), che favoriscono il processamento dei precursori poliproteici virali. Inoltre, alcuni residui della retrotrascrittasi sembrano svolgere un ruolo critico nella corretta regolazione della maturazione dei precursori Gag e Gag-Pol (Nishitsuji et al., 2011; Chiang et al., 2012). Sebbene sia aumentata la consapevolezza della rilevanza che hanno altri domini proteici di HIV-1, oltre agli enzimi PR ed RT, nella predizione ed acquisizione delle farmacoresistenze, non sono ancora chiarite le ricadute funzionali che tali specifici mutazioni hanno nel ciclo biologico del virus. Inoltre, i dati disponibili non sono ancora unanimi nel definire l’importanza relativa di ciascuna regione analizzata, ad esempio nella proteina Gag (Dam et al., 2009; Parry et al., 2007). In tale contesto, abbiamo voluto investigare il ruolo svolto dalla proteina Gag come substrato naturale della proteasi virale ed il suo contributo nei meccanismi di resistenza. Sono state quindi ottimizzate le condizioni di amplificazione e di sequenziamento del gene gag a partire da isolati virali di diverso sottotipo. In collaborazione con il Professor Parisi, Università degli Studi di Padova, sono stati selezionati dei pazienti HIV-1 positivi che hanno fallito il trattamento terapeutico basato su PIs e RTIs all’interno della coorte Veneta CAVeAT, comprensiva di cinque Unità di Malattie Infettive. Di ciascuno di questi sono stati analizzati i profili di resistenza e le sequenze del gene gag per identificare le posizioni variabili. Allo scopo di determinare il contributo della proteina Pr55Gag nei meccanismi di resistenza e la sua specifica funzione nel ciclo biologico del virus, è stata disegnata una strategia di clonaggio che permette di analizzare il contributo differenziale della regione ammino- o carbossi-terminale di Gag in presenza o in assenza degli enzimi PR-RT mutati. Con questo sistema ciascun prodotto di amplificazione ottenuto dall’RNA estratto dal paziente può essere inserito direttamente nel genoma provirale di HIV-1. Nello specifico, è stato utilizzato un sistema di trans-complementazione dell’envelope, sviluppato in precedenza nel nostro laboratorio, che permette la pseudotipizzazione con envelope eterologhi espressi in trans di virioni competenti per un solo ciclo replicativo. Tra tutti i pazienti analizzati, è stato scelto di analizzare l’effetto di specifiche mutazioni a carico della regione N-terminale di Gag di quello che presentava un’unica mutazione di resistenza in PR. Dai risultati ottenuti è emerso che: (i) la presenza della regione N-terminale derivata dal paziente porta ad un aumento dell’attività retrotrascrittasica e del contenuto di p24 nel suranatante delle cellule utilizzate per la produzione dei virioni ricombinanti rispetto a quanto osservato nel virus wild type; (ii) nel sistema utilizzato la sequenza amminoacidica del sito di taglio MA/CA derivata dal paziente non sembra influenzare l’accessibiltà del sito per la proteasi wild type; (iii) le mutazioni a carico della regione N-terminale di Gag derivata dal paziente riducono l’infettività dei virioni ricombinanti che la esprimono. Nel complesso, i risultati ottenuti possono contribuire a caratterizzare le relazioni funzionali che intercorrono tra Gag e gli enzimi PR ed RT nei meccanismi di resistenza e nel ciclo biologico del virus