A preliminary survey of molecular factors involved in apple (Malus Domestica Borkh. CV Granny Smith) superficial scald development

Apple storage in controlled atmosphere (CA) can increase the marketing window of apples but at the same time it is an expensive practice and on the basis of cultivar, season, harvest time and storage condition (low O2, low/high CO2, low temperature) apples can develop different physiological disorders. It appears as a darkened area due to necrosis of hypodermal cells especially in Granny Smith and Red Delicious cultivars. Superficial scald annually causes the major economic loss to apple growers worldwide. It can arise after a relative long period (2-4 months) of cold storage with an increase in severity when apples are removed from storage and are leaved at room temperature (ca 7 dd). It is also influenced by different preharvest factors including fruit ripening at harvest, environmental conditions during growth, ethylene action or fruit mineral content. Superficial scald is associated with the accumulation of volatiles, in particular of α-farnesene, the biosynthesis of which is influenced by ethylene. This compound can be oxidized along with the storage period to a group of molecules called conjugated trienols. The accumulation of these oxidative products can induce metabolic dysfunction and cell death. Different strategies are provided to successfully inhibit scald development. The most common techniques in use combine storage in control atmosphere (CA) with treatments with the antioxidant diphenylamine (DPA), or with 1-methylcyclopropene (1-MCP), an inhibitor of ethylene perception and the most effective molecule to control scald, or application of an initial low oxygen stress (ILOS), followed by CA storage. In 2011 the use of DPA has been banned in Europe for health concerns, 1-MCP is effective but has high costs, while ILOS is difficult to apply requiring more research for its optimization and apples cannot be stored for long periods. The identification of the molecular mechanism involved in the regulation of superficial scald development may allow the possibility to predict at harvest, before CA storage, which apple batches may probably develop the disorder allowing rational storage strategies with significant economic gains. The aim of this work was to provide a preliminary characterization of the molecular factors putatively involved in scald development associated with ethylene action and ROS metabolism, two actors that seem to have a role in scald occurrence, in peels of apples, cv Granny Smith, treated or not with 1-MCP or DPA and stored in controlled atmosphere for 1, 3 or 6 months. For this purpose gene families involved in the maintenance of ROS homeostasis were identified in the apple genome. In particular ROPs and ancillary proteins ROP-GEFs, -GAPs and -GDIs, RBOHs (NADPH oxidases involved in the generation of ROS at the apoplastic levels) and PLsDα (involved togheter with ROPs in the regulation of RBOHs activity) were identified. It is known in fact that Arabidopsis cells during oxygen deprivation activate a mechanism controlled by negative feedback regulation which involves ROPs, ROP-GAPs, RBOH and H2O2, and it is termed the ROP-GAP rheostat. Expression analyses on the identified genes evaluated by real-time PCR allowed the identification of 2 ROPs, 7 ROP-GEFs, 8 ROP-GAPs, 2 RBOHs and 2 PLsDα de-repressed in samples treated with 1-MCP and in most cases with a minor extent, by DPA treatment. The expression of the same genes was evaluated by qPCR on peels of apples subjected to short-time treatments with a saturating concentration (100 ppm) of ethylene for 4 and 24 hours showing that ethylene negatively regulates many of the apple ROP-GAP rheostat genes including RBOHs and PLsDα. Then analyses of content of malonyldialdehyde, a marker of lipid peroxidation, H2O2, ascorbate and glutathione, suggested that cells of untreated apples, which showed scald symptoms in the 97% of cases after 6 months of storage, perceived the oxidative stress associated with the loss of H2O2 homeostasis. On the contrary samples treated with 1-MCP showed higher levels of H2O2 thus maintaining the H2O2 homeostasis. This finding was further confirmed by the up-regulation of transcription of alcohol dehydrogenase, a marker of H2O2 response. The subcellular localization of H2O2, obtained by means of cerium chloride reaction through transmission electron microscopy, revealed higher levels of H2O2 in the apoplast of apple peels treated with 1-MCP compared to control ones, confirming a role of RBOHs and their regulative system on control of apoplastic H2O2 homeostasis. Finally RNA-seq analyses on the same samples, allowed to construct an heatmap that highlighted in samples treated with 1-MCP a co-regulation between genes of the ROP-GAP rheostat and of the ROP system, and genes belonging to the ascorbate, dehydroascorbate reductase and thioredoxin families, involved respectively in the detoxification or protection of thiol groups by ROS action. These results demonstrate for the first time that during cold stress ethylene induces in apples that develop scald a disruption of ROS homeostasis caused by the loss of ROP-GAP rheostat and RBOHs regulation, thus provoking a different transcriptional response of genes involved in ROS detoxification.

La conservazione delle mele per lunghi periodi è resa possibile grazie all’introduzione di tecniche quali la conservazione in atmosfera controllata e permette ai produttori di aumentare la finestra temporale di commercializzazione di questo frutto sul mercato. È una procedura costosa che può causare a seconda delle varietà di mele conservate, della stagionalità, del periodo di raccolta dei frutti e delle condizioni di conservazione applicate (bassa concentrazione di O2, bassa/alta concentrazione di CO2, bassa temperatura) la comparsa di diversi disordini fisiologici. Tra i disordini più comuni che colpiscono le mele prodotte e vendute in Italia vi è il riscaldo superficiale che si manifesta come un’area necrotica a livello della buccia nelle varietà sensibili quali Granny Smith e Red Delicious. Il riscaldo superficiale causa la maggior perdita di mele e di conseguenza il maggior danno economico ai produttori di tutto il mondo. Il riscaldo insorge in seguito a periodi di conservazione a basse temperature relativamente lunghi (2-4 mesi) e successiva conservazione a temperatura ambiente (ca 7 gg) dopo l’uscita dalle celle. È un disordine la cui comparsa è influenzata anche da fattori indipendenti dalla conservazione quali lo stadio di maturazione dei frutti alla raccolta, le condizioni ambientali durante la crescita, l’azione dell’etilene o ancora il contenuto minerario. Ad oggi studi fisiologici e biochimici su Granny Smith hanno evidenziato come l’α-farnesene, un volatile presente nella buccia delle mele il cui processo finale di biosintesi è influenzato dall’etilene, possa andare incontro ad un processo di ossidazione quando le mele vengono poste nelle celle di conservazione in atmosfera controllata. L’accumulo dei prodotti ossidativi derivanti, tra cui i trienoli coniugati porterebbe alla degenerazione del tessuto. Diverse strategie sono state adottate negli anni per prevenire la comparsa dei sintomi del riscaldo tra cui l’impiego dell’antiossidante difenilamina (DPA), dell’inibitore della percezione dell’etilene 1-metilciclopropene (1-MCP) o l’applicazione di un iniziale stress a basso ossigeno (ILOS -initial low oxygen stress-) durante le prime settimane di conservazione. L’impiego del DPA è stato proibito in Europa dal 2011, mentre i trattamenti con 1-MCP assicurano il controllo del riscaldo ma hanno costi elevati, infine lo stress iniziale a basso ossigeno non permette una conservazione per lunghi periodi e necessita di continui monitoraggi per evitare che le mele sviluppino disordini legati allo stress da basso ossigeno. Conoscere i meccanismi molecolari che regolano la comparsa e lo sviluppo dei sintomi del riscaldo potrebbe permettere di identificare alla raccolta le partite di mele soggette alla manifestazione del disordine, così da individuare quali partite conservare o meno e garantire un guadagno economico al produttore. Lo scopo di questo lavoro è stato quindi cercare di caratterizzare in maniera preliminare su campioni di bucce di mele della varietà Granny Smith, trattate o meno con 1-MCP o DPA e conservate in atmosfera controllata per 1, 3 o 6 mesi, i possibili fattori molecolari coinvolti nel riscaldo, in associazione con l’attività dell’etilene e del metabolismo ROS, due agenti che dai dati in letteratura sembrano avere un ruolo nello sviluppo del riscaldo. A questo scopo sono state caratterizzate in melo le famiglie geniche coinvolte nel mantenimento dell’omeostasi dei ROS. In particolare le ROP e le proteine accessorie ROP-GEF, -GAP e -GDI, le RBOH (NADPH ossidasi coinvolte nella produzione dei ROS a livello apoplastico) e le PLDα (coinvolte nella regolazione dell’attivazione delle RBOH insieme alle ROP) in quanto è noto che in Arabidopsis, in condizioni di basso ossigeno, le cellule attivano un meccanismo regolativo a feedback negativo che coinvolge in generale ROP, ROP-GAP, RBOH e H2O2, e prende il nome di reostato ROP-GAP. Tramite real-time PCR sono state analizzate le espressioni trascrizionali dei geni identificati, individuando 2 ROP, 7 ROP-GEF, 8 ROP-GAP, 2 RBOH e 2 PLDα che vengono de-repressi nei campioni trattati con 1-MCP, e in maniera minore anche dal trattamento con DPA. Trattamenti di 4h e 24h con etilene esogeno hanno permesso di dimostrare che alcuni di questi geni de-repressi in presenza di 1-MCP vengono effettivamente regolati in maniera negativa dall’etilene. Successivamente le analisi effettuate sul contenuto in malonildialdeide, un marcatore della perossidazione lipidica, in H2O2, ascorbato e glutatione, suggeriscono che le cellule delle mele non trattate, che nel 97% dei casi hanno manifestato riscaldo alla fuoriuscita dalle celle, presentino una situazione di stress associata alla perdita dell’omeostasi dell’H2O2 che viene invece mantenuta nei campioni trattati con 1-MCP i quali presentano anche un aumento dei livelli trascrizionali di alcol deidrogenasi (ADH), un marcatore della risposta all’H2O2. La localizzazione subcellulare dell’H2O2, determinata col cerio cloruro tramite microscopia elettronica, ha rilevato poi maggiori livelli di H2O2 a livello dell’apoplasto nelle bucce dei campioni trattati con 1-MCP rispetto al controllo, confermando quindi un ruolo delle RBOH e del loro sistema regolativo nel mantenimento di livelli omoeostatici di H2O2 nell’apoplasto. Infine in seguito ad un’analisi RNA-seq sugli stessi campioni, è stato possibile costruire una heatmap che ha evidenziato solo nei campioni trattati con 1-MCP una evidente co-regolazione tra i geni identificati del reostato ROP-GAP, e in generale del sistema ROP, e le sequenze geniche appartenenti alle famiglie delle ascorbato perossidasi, monodeidroascorbato reduttasi e tioredossine coinvolte rispettivamente nella detossificazione e nella protezione dei gruppi tiolici dall’azione dei ROS. Nell’insieme i risultati ottenuti dimostrano per la prima volta che durante lo stress da freddo la presenza dell’etilene induce nei campioni che manifestano riscaldo una perdita dell’omeostasi dell’H2O2 causata dalla mancata regolazione del reostato ROP-GAP e delle RBOH, che porta all’attivazione di una diversa risposta trascrizionale dei geni coivolti nella detossificazione dei ROS.