A transcriptomic approach to dissect the effect of grapevine rootstocks on plant tolerance to abiotic stresses and berry ripening

Grapevine represents one of the major economic crop species on a worldwide scale, with a world production approaching 70 million of tons and a harvest area of over 7 million hectares. Amongst the 60 species within the Vitis genus, Vitis vinifera L. is the mostly used for the production of wine and distilled liquors. Before the devastation of European viticulture caused by of the introduction of phylloxera from North America, varieties of V. vinifera used commercially for wine production in Europe were traditionally grown on their own roots. Subsequently, the use of rootstocks from the pest’s origin was introduced to provide resistance to this and other deleterious diseases and to save the fate of European viticulture. Rootstocks have been bred from a number of Vitis species, especially V. berlandieri, V. riparia, and V. rupestris, and are known, in addition to the enhanced resistance to phylloxera and other pathogens, confer tolerance to abiotic stresses (e.g. drought, high salinity and Fe-deficiency), regulate the size of the scion, affected fruit development/ripening, contribute to fruit quality and can alter specific aspects of postharvest fruit quality of a scion. Results presented in this Ph.D thesis are a part of a larger multi-disciplinary project called SERRES (Selection of new grape rootstocks resistant to abiotic stresses through the development and validation of molecular markers) granted by Ager foundation. Selection of resistant rootstocks is crucial for the development of sustainable agricultural models and, at the same time, for inducing a balanced vegetative/productive ratio, a different ripening progression in grape berries and, as well as, differences in their global quality. Improving the knowledge about the molecular, biochemical and physiological bases of stress resistance is an absolute requirement for the selection of genotypes able to cope with stress conditions without any negative consequences on the vegetative growth and production of high quality grape. Drought has an enormous impact on crop production, indeed, it is one of the major factors limiting plant productivity and cause a severe yield reduction. Based on the global climate models, which predict an increase in the aridity in the next future, water deficit may became the major limiting factor. In this context rootstocks may play an important role in limiting crop loss by improving water use efficiency, potential for survival, growth capacity and scion adaptability to stress conditions. Water deficit leads to many morphological and physiological changes across a range of spatial and temporal scales, including reduced expansion of aerial organs, maintenance of root growth, decrease in transpiration and photosynthesis, accumulation of osmotic compounds and ions, activation of detoxifying processes and, in parallel, the transcriptional regulation of a large number of genes. Oxidative stress is related to the accumulation of reactive oxygen species, such as H2O2, O2-, -OH, 1O2, and NO. These ROS are responsible for most of the oxidative damages in biological systems and cellular components. Thus, a strict control of ROS levels, throughout the expression of genes coding for superoxide dismutases (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase and glutathione peroxidise ROS scavenging enzymes, is mandatory for plant survival and the cross-talk between ROS accumulation and redox state is integrating part of a fine homeostasis control that plays a pivotal role in the plant response to stresses. Recently, a biochemical and physiological study of the M4 [(V. vinifera x V. berlandieri) x V. berlandieri x cv Resseguier n.1] novel candidate genotype to be used as rootstock in grapevine was performed. This genotype, established from 1985 by the DiSAA research group operating at the Milan University, was selected for its high tolerance to water deficit (WS) and salt exposure (SS). In comparison with the 101.14 commercial genotype, M4 un-grafted plants subjected to water and salt stress showed a greater capacity to tolerate WS and SS maintaining photosynthetic activity also under severe stress conditions and accumulating, especially at the root level, osmotic compounds and ions. In the first part of this thesis were reported results obtained from a large scale whole transcriptome analyses (RNA-seq) performed on root (whole apparatus) and leaf tissues of 101.14 (drought susceptible) and M4 plants sampled in progressive drought (five time points). Physiological analyses were performed on treated (water-stress, WS) and control (well-watered, WW) plants over all the sampling. The multifactorial analysis , which was performed on mRNA -seq data concerning to both the analyzed tissues (leaf and root), allowed us to evaluate the relative weight of the genotype (R: 101.14 and M4), of the type of stress imposed (Treatment, T: WW and WS) and of the time point considered (P: T1-T4), and to identify Differentially expressed Genes (DEGs) that are affected in a specific way or the combined action of these factors (R:T, R:P, T:P and R:T:P). In WS root dataset, all considered components (R, T and P) were found to affect the higher number of genes in comparison to other dataset (WS leaf). A first general observation comparing results of the multifactorial analyses performed on leaves and roots is that in root tissue the “treatment” seems to be the main variable explaining differential gene expression depend on the kind treatment imposed, whereas in leaf tissue the weight of the genotype (rootstock) appear to be the highest. This observation is not surprising, considering that the root system is the first organ perceiving the water deprivation stress and the main one actively responding to it. In this case it’s clear the kind of treatment imposed represent the main variable influencing expression whereas the effect of the genotype is less determinant on differential expression of genes. RNA-seq data were used to performed a Differential Cluster Analysis (DCA), which is based upon comparison of correlation between genes expression of a “reference” and a “target” organism and allowed us to identify conserved and diverged co-expression patterns between related organisms. This analysis allowed us to compared the transcriptomic responses of M4 and 101.14 rootstocks. As concerns plant hormones, it was showed an induction of auxin, JAs and GAs related-genes at the beginning of the stress kinetic in M4 stressed roots, whereas a up-regulation of these transcripts in unstressed root was observed in 101.14. The most interesting metabolic category was the “Secondary metabolism” one because several DEGs belonging to these metabolisms were founded in both root and leaf upon WS, but with a strong specificity of DEGs expression among two considered organs. Indeed, upon WS, roots and leaves of the tolerant genotype M4 exhibit an higher induction of stilbenes (i.e. STS) and flavonoids (e.g. CHS, F3H, LDOX, FLS) biosynthetic genes, respectively. We hypothesized the role of these genes in the control and balance ROS levels, in addition to the others well known ROS scavengers. In presence of water stress, M4 rootstock may acts differential mechanisms in root and leaves which leads to the production of molecules, such as resveratrol and flavonoids and these events may be related to a secondary antioxidant system in this rootstock. The higher resistance of M4 rootstock to water stress, in comparison to what observed in 101.14, should be related to these events. In the second part, in order to evaluate the effects of the rootstocks on grape berry quality and development/ripening, an RNA-seq experiment on Cabernet Sauvignon (CS) grafted onto M4 and 1103 Paulsen rootstocks was carried out. Whole berries were collected from CS/1103P and CS/M4 bunches at 45, 59, 65 days after full bloom (DAFB), in correspondence to the end of lag phase. At this moment most of grape berries reached véraison, the other samples (separating skin and pulp) were collected at 72, 86 and 100 DAFB. On the basis of physical (volume and colour) and chemical (Soluble Solids Concentration, SSC) parameters, the two rootstocks seem to induce a different development and ripening pattern on CS berries. To identify the same developmental phases of berries collected from CS/1103P and CS/M4, the expression profile of genes involved in phenols, sugar and organic acids metabolisms were overlapped. This approach allowed to establish that the green phase occurred at 45 DAFB in both combinations, while véraison happened at 72 and 86 DAFB for CS/M4 and CS/1103P, respectively. An mRNA-seq and a microRNA-seq experiments were carried out on CS berries sampled at pre-véraison (45 DAFB), véraison (72 and 86 DAFB for M4 and 1103P, respectively) and traditional CS vintage date (100 DAFB). For the statistical analyses on RNA-seq data a pairwise comparisons between M4 and 1103P genotypes were accomplished at each time point and a large numbers of DEGs related to auxin metabolisms were identified with enrichment and clustering analysis. It is well known the important role of auxins on grape berry development, so, it was decided to focus our attention on this hormone and to performed a characterization of grape ARF and AUX/IAA gene families. Indeed, in another work presented in this thesis, we showed that an NAA treatment just before véraison caused delayed grape berry ripening at the transcriptional and physiological level, along with the recovery of a steady state of its intracellular concentration. Hormone indices analysis carried out with the HORMONOMETER tool suggests that biologically active concentrations of auxins were achieved throughout a homeostatic recovery. This occurred within 7 days after the treatment, during which the physiological response was mainly unspecific and due to a likely pharmacological effect of NAA. This hypothesis is strongly supported by the up-regulation of genes involved in auxin conjugation (GH3-like) and action (IAA4- and IAA31-like). Considering these results, the differences observed among CS/M4 and CS/1103P in grape berry development and ripening should be related to a different regulation of auxin metabolism. Indeed, all transcripts/miRNAs analyses performed (RNA-seq, microRNA-seq and qPCR) highlighted important differences in the auxin metabolism among the two scion/rootstock combination. Our data suggest an important involvement in the control of grape berry development/ripening of genes that are related, on one hand to auxin action (ARF and AUX/IAA) and, on the other hand, to homeostasis of this hormone through the expression of genes involved in conjugation (GH3) and transport (PIN and ABCB). In this context, also miRNA have an important role, especially by controlling ARF–related genes (e.g. miR160 and miR167). In the case of fruit ripening, auxin acted as a positive regulator of genes that control grape berry size (e.g. expansin-related genes) before the véraison stage; it was indeed observed the up-regulation at the pre-véraison stage, which was different for CS/M4 and CS/1103P, of transcripts that control auxin-responsive genes (e.g. VvARF8A and VvARF1A). The induction of genes that belonged to ARF family was paralleled by the expression of transcripts that control auxin level(e.g. VvGH3-1) and action (VvIAA9, VvIAA15A, VvIAA16), suggesting that an accurate regulation of auxin homeostasis in grape berries at these phases. Moreover, control of auxin levels in grape berry seems pass through other mechanisms which involved control of transport-related genes in the early (ABCBs) and late (PINs) phases of berry development. Taking into accounts that at commercial CS harvest, CS/M4 berries berries were showing differences in some processes ripening-related (e.g. flavonoids metabolism) and a different regulation of auxin metabolisms, when compared to those of CS/1103P, auxin seems to act as negative regulators on some genes related to grape berry ripening but its induction at the pre-véraison stage could be necessary to triggers other metabolism involved in ripening processes.

La vite (genere Vitis) rappresenta una delle principali specie coltivate su scala mondiale , con una produzione che si avvicina ai 70 milioni di tonnellate e una superficie coltivata di oltre 7 milioni di ettari . Tra le 60 specie all'interno del genere Vitis, Vitis vinifera L. è la più utilizzata per la produzione di vino e distillati. Prima della devastazione della viticoltura europea causata dall'introduzione del parassita fillossera dal Nord America, le varietà di V. vinifera usate per la produzione di vino in Europa non erano innestate. Successivamente, l'utilizzo di portinnesti di origine americana ha permesso di fornire una maggiore resistenza al parassita e ad altre malattie che stavano seriamente compromettendo la viticolture Europea. I portinnesti più usati commercialmente derivano da incroci di svariate specie di vite, tra cui V. berlandieri, V. riparia e V. rupestris, e, oltre a migliorare la resistenza alla fillossera e altri patogeni, conferiscono caratteristiche di tolleranza a stress abiotici (come siccità, elevata salinità e Fe-carenza), regolano la crescita dell’acino, contribuiscono alla maturazione e alla qualità dei frutti, possono alterare alcuni aspetti legati alla qualità in post-raccolta dell’acino. I risultati presentati in questa tesi di dottorato sono parte integrante di un progetto multi- disciplinare chiamato SERRES (selezione di nuovi portinnesti di vite resistenti a stress abiotici attraverso lo sviluppo e la validazione di marcatori molecolari) e finanziato dalla fondazione Ager. La selezione e la caratterizzazione di portainnesti che conferiscano un maggiore grado di tolleranza agli stress abiotici è essenziale per lo sviluppo di modelli agricoli sostenibili e, allo stesso tempo, per l’induzione di un rapporto equilibrato tra fase vegetativa e produttiva, una progressione diversa della maturazione dell’uva, così come, differenze a livello qualitativo. Migliorare la conoscenza delle basi molecolari, biochimiche e fisiologiche della resistenza allo stress è un requisito fondamentale per la selezione di genotipi in grado di far fronte alle condizioni di stress senza conseguenze negative su crescita vegetativa e produzione di uva ad alta qualità. Lo stress idrico ha un impatto enorme sulla produzione agricola, infatti, è uno dei principali fattori che limitano la produttività delle piante e causano una grave riduzione della resa. Sulla base dei modelli climatici globali, che prevedono un aumento delle aree aride nel prossimo futuro, la carenza idrica può diventare il principale fattore limitante per la coltivazione. In questo contesto, i portinnesti potrebbero assumere un ruolo importante nel limitare la perdita di raccolto migliorando l'efficienza dell'uso dell'acqua, il potenziale di sopravvivenza della pianta e la capacità di crescita del frutto in presenza di condizioni avverse come siccità ed elevata salinità del suolo (stress osmotici). Lo stress idrico porta a molti cambiamenti morfologici e fisiologici, tra cui ridotta espansione della parte aerea, limitazione della crescita radicale, diminuzione della traspirazione fogliare e dell’efficienza fotosintetica, accumulo di ioni e osmoliti, attivazione di processi di disintossicazione e parallelamente la regolazione a livello trascrizionale di un elevato numero di geni. In seguito allo stress idrico, si innesca uno stress secondario legato all’accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), quali H2O2, O2-, -OH, 1O2 e NO. Le ROS sono responsabili della maggior parte dei danni ossidativi nei sistemi biologici e nelle componenti cellulari. Un rigoroso controllo dei livelli delle ROS è obbligatorio per la sopravvivenza delle piante e il cross-talk tra l’accumulo di ROS lo stato redox è parte integrante di un preciso controllo omeostatico che gioca un ruolo fondamentale nella risposta agli stress. Le piante innescano svariati meccanismi di riduzione del livello di ROS (ROS-scavenging) volti all’induzione dell’espressione di geni che codificano per gli enzimi superossido dismutasi (SOD) , catalasi (CAT), ascorbato perossidasi e glutatione perossidasi. Recentemente è stato condotto uno studio di caratterizzazione a livello biochimico e fisiologico di M4 [(V. vinifera x V. Berlandieri) x V. berlandieri cv Resseguier n.1], un nuovo genotipo di vite candidato ad essere utilizzato come portinnesto. Questo genotipo, studiato dal 1985 dal gruppo di ricerca DiSAA dell'Università degli studi di Milano, è stato selezionato per la sua alta tolleranza allo stress idrico (WS) e salino (SS). Se confrontate con il genotipo commerciale 101.14, le piante di M4 sottoposte a deficit idrico hanno mostrato una maggiore capacità di tolleranza e una più elevata attività fotosintetica anche in condizioni di stress gravi. Nella prima parte di questa tesi sono stati osservati i risultati ottenuti da un’analisi trascrittomica condotta su larga scala (RNA -Seq), effettuata su foglie e radici dei portinnesti M4 e 101.14 campionati in condizioni di stress idrico progressivo (5 time-points). Le analisi fisiologiche sono state effettuate sulle piante trattate (deficit idrico, WS) e di controllo (irrigate, WW) lungo tutto il campionamento. L'analisi multifattoriale, che è stata condotta sui dati mRNA-Seq, ci ha permesso di valutare il peso di tre diverse componenti sulla risposta allo stress: genotipo ( R : 101.14 e M4 ), tipo di stress imposto (Trattamento, T : WW e WS) e time-point considerato ( P : T1 - T4 ). Con questa analisi stato inoltre possibile identificare i geni differenzialmente espressi (GDE) legati all’azione specifica o combinata di questi fattori (R:T , R:P , T:P e R:T:P). In WS radice si è sempre osservati un numero maggiore di GDE rispetto alla foglia. Una prima osservazione generale confrontando i risultati delle analisi multifattoriali eseguite su foglie e radici, è che nel tessuto radice il "trattamento" sembra essere la variabile che ha un impatto maggiore sull’espressione genica, mentre nel tessuto fogliare il peso del genotipo (portinnesto) sembra essere il più elevato. Questa osservazione non è sorprendente, considerato che il sistema radicale è il primo organo a percepire lo stress causato dalla carenza idrica e quello principale atto alla risposta. In questo caso è chiaro che il tipo di trattamento imposto rappresenta la variabile principale che influenza l’espressione genica mentre l'effetto del genotipo è meno determinante. Con i dati RNA-seq è stata eseguita una “Differential Cluster Analysis” (DCA), che si basa sul confronto delle correlazioni tra le espressioni dei trascritti di un organismo “reference” e di un “target”. Questa analisi ci ha permesso di identificare i pattern di co-espressione genica (T1-T4) conservati e pattern non-conservati tra M4 e 101.14. Per quanto riguarda gli ormoni vegetali, è stata osservata un’induzione dei geni legati ad auxine, jasmonati ed etilene nelle radici di M4 sottoposte a stress, mentre una sovra-regolazione degli stessi trascritti è stata osservata in 101.14. La categoria metabolica più interessante, emersa dall’analisi DCA, è quella legata ai metaboliti secondari. Infatti sono stati individuati diversi GDE legati a questa categoria sia in radice che in foglia di M4, indotti in condizioni di stress, ed è stata evidenziata una forte specificità di espressione tra i due tessuti. Infatti, in condizioni di carenza idrica, radici e foglie del genotipo tollerante M4 mostrano rispettivamente una maggiore induzione dei geni legati agli stilbeni (i.e. STS) e ai flavonoidi (e.g. CHS, F3H, LDOX, FLS). Il ruolo di questi geni potrebbe essere legato al controllo e al bilanciamento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), in aggiunta ai classici meccanismi di ROS-scaveging (meccanismi antiossidanti primari). In presenza di stress idrico, M4 potrebbe attuare meccanismi differenziali in radice e foglie che portano alla produzione di molecole, come resveratrolo e flavonoidi, correlate ad un sistema antiossidante secondario presente solo nel portinnesto più tollerante. La maggiore tolleranza allo stress idrico di M4, in confronto a quanto osservato in 101.14, potrebbe essere relativo a questi eventi. Nella seconda parte di questa tesi, è stato valutato l’effetto dei portinnesti M4 e 1103P su sviluppo, maturazione e qualità delle bacche di Cabernet Sauvignon (CS). Per questo esperimento sono stati campionati da piante di CS/M4 e CS/1103P acini interi a 45, 59 e 65 giorni dopo la piena fioritura (GDF). Successivamente la maggior parte delle bacche di CS/M4 avevano raggiunto l’invaiatura, si è quindi deciso di separare bucce e polpe per i campionamenti successivi, condotti a 72, 86 e 100 GDF. Sulla base dei parametri fisici (volume e colore) e chimici (solidi solubili totali, SSC), i due portinnesti hanno mostrato una diversa influenza sulla cinetica di sviluppo e maturazione delle bacche di CS. Per identificare le stesse fasi di sviluppo dei frutti raccolti da CS/1103P e CS/M4, è stato condotta un’analisi di espressione preliminare, mediante sistema real-time PCR, sui geni coinvolti nella biosintesi di fenoli, zuccheri e acidi organici. Questo approccio ha permesso di identificare la fase verde a 45 DAFB in entrambe le combinazioni d’innesto, mentre l’invaiatura è stata individuata a 72 e 86 DAFB rispettivamente per CS/M4 e CS/1103P. Le analisi mRNA-seq e micro-RNAseq sono state effettuate sulle bacche in fase di pre-invaiatura (45 GDF), invaiatura (72 GDF per CS/M4 e 86 GDF per CS/1103P) e epoca di raccolta tradizionale di CS (100 GDF). Le analisi statistiche sono state condotte sui dati RNA-seq confrontando il rapporto tra i dati di espressione di CS/M4 e CS/1103P ad ogni punto della cinetica e per entrambi i tessuti. Le analisi di “clusterizzazione” e di arricchimento hanno evidenziato la presenta di un elevato numero di GDE legati a metabolismi auxinici. Le auxine hanno un ruolo fondamentale durante lo sviluppo e sulla maturazione della bacca, si è quindi deciso di concentrare la nostra attenzione su questa classe ormonale e di eseguire una caratterizzazione e un’analsi filogenetica delle famiglie geniche ARF e AUX / IAA sul genoma di PN40024. Il ruolo delle auxine in questi processi è stato studiato anche in un altro un altro lavoro presentato in questa tesi, durante il quale è stato dimostrato che un trattamento sugli acini d’uva in fase di pre-invaiatura con l’auxina sintetica NAA causa un ritardo nella maturazione, che si manifesta a livello fisiologico e di espressione genica, parallelamente alle quali è stata osservata l’induzione di un elevato numero di trascritti atti a controllare l’omeostasi delle auxine. Le analisi condotte con il software HORMONOMETER hanno suggerito che il recupero omeostatico atto a portare i livelli dell’ormone a concentrazioni meno elevate è avvenuto a soli 7 giorni dal trattamento. Questa ipotesi è fortemente supportata dalla sovra-regolazione di geni coinvolti nella coniugazione (GH3 -like) e nell'azione ( IAA4 e IAA31 -like) delle auxine. Considerando questi risultati, le differenze osservate tra CS/M4 e CS/1103P durante lo sviluppo e la maturazione della bacca potrebbero essere collegate ad una diversa regolazione dell’auxina. Infatti, i dati di espressione (mRNA-seq, microRNA-seq e qPCR) evidenziato importanti differenze nel metabolismo auxinico tra le due combinazioni d’innesto. I nostri dati suggeriscono un coinvolgimento importante dell’ormone nel controllo dello sviluppo/maturazione della bacca grazie all’espressione di legati, da un lato all’azione delle auxine (ARF e AUX/IAA) e, dall'altro , all’omeostasi di questo ormone attraverso trascritti coinvolti nella coniugazione (GH3) e nel trasporto (PIN e ABCB). In questo contesto , anche i miRNA hanno un ruolo importante, in particolare esercitando un controllo sulla trascrizione dei geni ARF (e.g. miR160 e miR167). In fase di pre-invaiatura, le auxine hanno un’azione positiva sulla trascrizione dei geni che controllano le dimensioni della bacca (e.g. espansine) e di geni legati alla famiglia delle ARF (ad esempio VvARF8A e VvARF1A ). Parallelamente all'induzione di geni che appartengono alla famiglia ARF, è stata osservata l’induzione di trascritti che controllano i livelli (e.g. VvGH3-1) e l'azione (VvIAA9, VvIAA15A, VvIAA16) dell’ormone, suggerendo un’accurata regolazione dei livelli auxinici in queste fasi importanti dello sviluppo del frutto. Inoltre, il controllo dei livelli di auxina nella bacca d’uva sembra essere legato anche ad altri meccanismi legati all’induzione di geni legati al trasporto ormonale durante le fasi precoci (ABCBs) e tardive (PIN) della maturazione del frutto. Tenendo conto delle differenze osservate tra CS/M4 e CS/1103P nell’espressione di trascritti legati al metabolismo dell’auxina, questo ormone sembra esercitare un’azione negativa su alcuni geni legati alla maturazione della bacca (e.g. flavonoidi), ma la sua induzione nella fase di pre-invaiatura potrebbe essere necessaria per far scattare altri processi metabolici coinvolti nella maturazione dell’acino d’uva.