Soil microbial communities in environmental-agronomical context: quantitative analysis, metagenomics and signal exchange monitoring

Soil is one of the most challenging environments for microbiologists. The astounding number of microbial species living in soil makes it one of the most diverse and still mysterious environments known. The study of the soil nitrogen cycle is gaining in importance, as recently a strong land-use intensification and increase in N fertilization led to the rising of threats to environmental and human health. Moreover, major interest is given to the investigation of the structure of soil microbial communities, to their responses in the presence of external stimuli, and to their capacity to organize thanks to the exchange of specific signals dispersed in the environment. In this study, these aspects of soil microbial ecology were taken into account, and microbiology and molecular biology techniques were used to probe the bacterial community function and structure and to study the physical diffusion of signals emitted by certain bacteria. Real Time PCR analysis of functional genes of the N-cycle in different soils highlighted interesting differences and permitted to select the bacterial amoA and nosZ genes, for nitrification and denitrification, respectively, as useful indicators of soil health and functionality. Furthermore, a strict relationship between bacteria involved in nitrification and in denitrification was found in all the analysed soil samples, indicating that these microorganisms could be part of the same environmental niche, though being involved in opposite processes. Through T-RFLP experiments and a metagenomic analysis by amplicon sequencing performed in a 454 system (Roche), the effects of different fertilizers on an agricultural soil microbial community were investigated. In particular, it was possible to determine how bacterial communities changed over time in response to this kind of inputs, and to have a first insight into the relation among some bacterial phyla, which fluctuated in parallel or in opposition. Concerning microbial cell-to-cell signalling, in this work, efforts were made to define the consequences of the reflecting or adsorbing boundary conditions on the physical diffusion of AHL molecules, and therefore on bacterial intercellular communication, by combining physics and microbiology approaches. It was observed that the properties of the boundaries play a major critical role on the quorum sensing AHL concentration profiles around the cell environment.

Il suolo rappresenta uno degli ambienti più misteriosi e ricchi di biodiversità sulla Terra, e, nella maggior parte dei casi, i microrganismi adattati a vivere in questo ambiente non sono coltivabili e non sono stati ancora caratterizzati. Questo lavoro di tesi ha lo scopo di analizzare la complessità dell’ecologia microbica del suolo da due punti di vista diversi: da una parte si vuole ottimizzare e utilizzare tecniche di biologia molecolare per esaminare la struttura e la funzione delle comunità microbiche di diversi suoli, e dall’altra parte lo scopo è quello di studiare le forme di comunicazione tra i batteri, e i segnali che essi scambiano tra loro (Quorum Sensing). Di recente, molti ricercatori si sono dedicati allo studio dei batteri e degli archaea coinvolti nel ciclo dell’azoto, poiché il disequilibrio in questo processo, causato principalmente dall’uso eccessivo di fertilizzanti azotati e da altre pratiche agricole, è una minaccia per la salute dell’uomo, oltre che per l’ambiente. Inoltre, anche lo studio delle comunità microbiche del suolo sta assumendo sempre più importanza, in particolare per quanto riguarda la loro risposta in presenza di stimoli esterni, e la loro capacità di organizzarsi grazie allo scambio di segnali specifici emessi nell’ambiente dagli stessi microrganismi. L’analisi dei geni funzionali per il ciclo dell’azoto mediante esperimenti di Real Time PCR quantitativa in suoli di diversa provenienza o trattati in modi diversi ha permesso di evidenziare differenze significative e di selezionare i geni amoA batterico e nosZ, rispettivamente per la nitrificazione e per la denitrificazione, come possibili indicatori della qualità del suolo e della produttività in agricoltura. Questo tipo di analisi ha anche permesso di osservare come ci sia, in tutti i suoli analizzati, una correlazione positiva e statisticamente significativa tra i geni batterici per la nitrificazione e per la denitrificazione. Questo risultato potrebbe indicare che questi due gruppi di microrganismi sono in qualche modo legati, e che probabilmente vivono nella stessa nicchia ecologica. In questo lavoro, mediante esperimenti di T-RFLP e grazie all’uso della tecnologia di Next generation sequencing 454 (Roche), è stato possibile analizzare la struttura della comunità microbica in suoli trattati con fertilizzanti di diverso tipo, a due tempi di campionamento. Inoltre, sono state ricercate le correlazioni tra i phyla presenti, in modo da avere una prima idea di come questi varino anche in relazione alla variazione dell’abbondanza di altri gruppi batterici. Grazie a questo esame sono state trovate molte correlazioni forti e significative, che indicano come alcuni gruppi batterici siano strettamente in relazione tra loro e si influenzino fortemente. Per quanto riguarda lo studio dei segnali scambiati tra batteri presenti in una stessa comunità, e quindi del Quorum Sensing e del Diffusion Sensing, sono stati analizzati i meccanismi fisici di diffusione delle molecole quorum AHL in ambienti circoscritti, ed in particolare sono state definite le conseguenze delle condizioni al contorno, sia nel caso di confini di natura riflettente che di natura assorbente. Queste proprietà sono risultate giocare un ruolo fondamentale nel determinare i profili di concentrazione della molecola segnale AHL.