Sviluppo di biomarkers per la determinazione e la valutazione prognostica della ripresa funzionale epatica post trapianto, nel fegato marginale e nel non heart beating donor

ABSTRACT Background One of the most crucial issues in liver transplantation is the gap between the increasing number of patients waiting for a transplant and the shortage of available grafts. This limitation has led many liver transplant units to include for surgery organs defined as “marginal” or “sub-optimal” due to hepatic steatosis or sourcing from non-heart-beating donors (NHBD). In turn, the marginality of these organ donors is proportional to a high incidence of liver dysfunction after transplantation due mainly to more severe ischemia-reperfusion injury events. The use of new methods of preservation of hepatic grafts like Machine Perfusion becomes necessary, especially for its ability to reduce the damage of ischaemia-reperfusion in hypothermia. This opens an interest towards the use of alternative methods in preserving hepatic graft as Machine Perfusion, able to reduce this type of insults and allow the dosage of biomarkers that can predict the extent of damage ischemia-reperfusion injury and the quality of functional recovery of the graft after transplantation. The great potential of this system in the context of organ preservation and the numerous studies in the literature led us to investigate this issue. Purpose The aim of our work was to carry out an experimental model of Machine Perfusion (MP) for the preservation of livers procured from non heart-beating donor, as a viable alternative to the traditional Cold storage (CS) at 4°C. A further aim of our project was to identify biomarkers that can be used as predictors of postoperative graft damage. Material and methods We used 10 Landrace pigs of about 20 kg to which we performed, 60 minutes after cardiac arrest, total hepatectomy, thus harvesting the liver. The animals were divided into two groups: in the first group (Group A) 5 livers was preserved for 6 hours in MP at 20° C. In the second group (Group B) 5 livers was stored for 6 hours in CS. In all study groups the period of preservation was followed by reperfusion in normothermic MP (37 °) with whole oxygenated blood previously collected from the donor animal for 2 hours to assess the response to reperfusion. During the experiment blood samples and histological specimens were collected. Results Graft preservation by Machin perfusion at 20°C is superior compared to the Cold Storage, both from biochemical (AST, ALT, LDH, lactate) and histological standpoint (necrosis and congestion). The dose of AST, ALT, LDH and lactate has proven be a reliable parameter for the assessment of organ damage and functional recovery of the graft liver. The dosage of cytokines such as IL1, IL6, TNF alpha showed no significance. Conclusion These experimental evidences highlight the effectiveness of a preservation with continuous perfusion at 20° C on a large animal model. Both from biochemical that histological standpoint, we have observed that Machine Perfusion in moderate hypothermia is beneficial in the preservation of the graft and offers the considerable advantage of being able to test, during perfusion, biomarkers that can predict hepatic graft recovery, before transplant, in order to reduce the incidence of post-transplant graft disfunction.

Riassunto Premesse generali Nell’ambito del trapianto di fegato, uno dei problemi più importanti non ancora risolti è la grande discrepanza tra la richiesta di organi e la risorsa di donazioni. Il ricorso ai così detti organi “marginali”, come quelli dei donatori a cuore non battente e con steatosi maggiore del 60%, potrebbe consentire di ampliare in maniera sensibile il pool degli organi disponibili per trapianto. L’impiego di questi fegati però è associato ad un’alta frequenza di Primary Disfunction postoperatoria a causa del danno che si sviluppa nel corso della preservazione in Cold Storage, nel contesto del processo di ischemia-riperfusione in ipotermia estrema (4°C). Si apre un’area di interesse di ricerca verso l’utilizzo di metodiche alternative nella conservazione del graft epatico come la Machine Perfusion, in grado di ridurre questo tipo di insulti e di consentire il dosaggio di biomarkers in grado di predire l’entità del danno da ischemia-riperfusione e la qualità della ripresa funzionale del graft dopo trapianto. Le grandi potenzialità di questo sistema nell’ambito della preservazione d’organo e i numerosi lavori in letteratura ci hanno spinto ad approfondire questa tematica. Scopo dello studio L’obiettivo del nostro lavoro è stato quello di realizzare un modello sperimentale di Machine Perfusion per la preservazione di fegati prelevati da donatore a cuore non battente, come valida alternativa alla preservazione tradizionale in Cold storage a 4°C. Ulteriore scopo del nostro progetto è stato quello di identificare eventuali biomarcatori in grado di predire l’entità del danno da ischemia-riperfusione e la qualità della ripresa funzionale del graft dopo trapianto di fegato da donatore a cuore non battente. Materiali e metodi Per questi esperimenti abbiamo utilizzato 10 maiali Landrace di circa 20 Kg ai quali abbiamo praticato, 60 minuti dopo l’arresto cardiaco, un’epatectomia totale, prelevando così il fegato. Gli animali sono stati suddivisi in due gruppi di 5 ciascuno: nel primo gruppo (Gruppo A) il fegato prelevato è stato perfuso in MP (Machine perfusion) per sei ore con soluzione di Celsior a 20°C. Nel secondo gruppo (Gruppo B) il fegato prelevato nei 5 animali è stato conservato per 6 ore in CS (Cold storage). In tutti i gruppi di studio il periodo di preservazione è stato seguito da un periodo di rewarming inteso come riperfusione dell’organo con sangue autologo in normotermia (37°) per due ore per valutare la risposta alla riperfusione. Durante tutte le otto ore dell’esperimento sono stati raccolti campioni ematici e istologici. Risultati Dal punto di vista biochimico (AST, ALT, LDH) e istologico (necrosi e congestione) la preservazione mediante perfusione a 20°C si è dimostrata superiore rispetto al Cold Storage. Il dosaggio di AST, ALT, Acido lattico ed LDH si è dimostrato essere un parametro attendibile per la valutazione del danno d’organo e della ripresa funzionale del graft epatico. Il dosaggio di citochine quali IL1, IL6, TNf alfa non ha mostrato alcuna significatività. Conclusioni Queste evidenze sperimentali mettono in rilievo l’efficacia di una preservazione con macchina a perfusione continua a 20°C sul grande animale. Sia dal punto di vista biochimico che istologico, infatti, abbiamo osservato che la Machine Perfusion in moderata ipotermia è di beneficio nella preservazione del graft ed offre il notevole vantaggio di poter testare, durante la perfusione, biomarcatori che possono predire l’eventuale ripresa funzione dell’organo, prima dell’esecuzione del trapianto, al fine di ridurre l’incidenza di disfunction del graft post trapianto.