Le applicazioni biotecnologiche nella medicina traslazionale

This paper aims to highlight the massive potential of the use of biotechnology in translational medicine. The thesis is tripartite on the basis of three separate searches it illustrated: each of them is characterized by the use of different biotechnological approaches. The first research has as its purpose the in vitro comparison of the osteogenic potential of mesenchymal stem cells taken from the bone marrow (hBMSCs) and adipose tissue (hASCs). Still, the research aims to evaluate in vitro the ability of two DBM (TBM and DBX) to stimulate the osteogenic differentiation of two populations of stem cells (hBMSCs and hASCs). The mesenchymal stem cells taken from the adipose tissue (Abdominal Liposuction) and bone marrow (Total Hip Replacement), were cultured in a Scaffold based on bovine bone (Orthoss) , in the presence of ground not differentiation with the addition of TBM and DBX . In this way , were obtained four different cell groups . After 28 days of incubation , were performed the MTT test (cell viability) and RT-PCR for the variation of gene expression of Osteopontin , Osteocalcin, Osteonectin and Collagen I. The MTT assay showed higher cell viability of the cultured cells with the TBM compared to cells cultured with the DBX and no significant difference between the two types of mesenchymal cells . The above results were also confirmed by RT-PCR, in which there is an increase in gene expression of the genes of the ' Osteopontin , Osteocalcin, Osteonectin and Collagen I in those cells cultured with TBM compared to cells cultured with the DBX and no significant difference between the two types of mesenchymal cells . In light of this , it is possible to assert that the results have demonstrated the absence of a significant difference in the osteogenic potential of mesenchymal stem cells taken from bone marrow and adipose tissue , it is also shown that the two DBM analyzed the TBM appears to be better than the DBX both as differentiation capacity as that cell survival. The second study is based on the study of the application of the diode laser gingival inflammation and regeneration , using low power levels (Low Level Laser Terapy) . The purpose of this research was to create a clinical protocol that can be used in dentistry. Human gingival fibroblasts were isolated from human gingival connective tissue , and plated in multiwell HYAFF biomaterial based on hyaluronic acid and irradiated with the laser diode at different power (1 W -24 mW) and different playing time (10 minutes - 75sec) . At the end of the day, at 24 and 48 h, the test was performed MTT (cell viability) and RT -PCR for the change of gene expression of genes of Collagen I and Fibronectin . From the MTT assay showed that the cells treated with the laser - with a power that varies between 24 mW and 110 mW, and a playing time that varies from 75 sec to 300 sec - express a cell viability greater compared to CTRL . These results were also confirmed by RT-PCR, in which there is an increase in gene expression of genes of Collagen I and Fibronectin than cells irradiated with a power ranging between 24 mW and 110 mW, and a playing time that varies from 75 sec to 300 sec . Consequently, it is possible to argue that a clinical protocol that could be used in dentistry is a low power ranging between 24 mW and 110mW, and a playing time ranging from 75sec to 300sec. The third research aims to study the in vivo effect of collagenase Vibro Alginoliticus on fibroproliferative disease of Dupuytren's hand. Dupuytren's disease is characterized by formation of a fibrotic cord sull'aponevrosi hand facial consisting of collagen I , but especially from collagen III . The fibrotic cords were taken to the operating room (Aponeverctomia Regional), transported to the laboratory , cut into pieces 5 mm , in each of which were injected with 20 uL collagenase. Some samples were subjected to mechanical actions of compressions vertical and longitudinal distensions ; subsequently, they were injected with 20 uL of collagenase , other samples were treated with the addition of 20 uL EDTA , for the presence of spots of calcifications observed thanks to Mallory Azan staining and confirmed by IHC for Osteopontin . 3-6-12-24-30 hours have been applied to the common histological techniques (Azan Mallory , IHC collage I, III and Collogene Osteopontin) . It was used, in addition, the semi-quantitative analysis of collagen III with ImageJ Software. Histologic analysis demonstrated a reduction of Collagen I and III in all samples treated with collagenase and the dissolution of the nuclei of calcification in those samples treated with EDTA . The semiquantitative analysis of Collagen III showed a progressive decrease of the signal of Collagen III at increasing time intervals and an increase in the effectiveness of the use of collagenase if the samples undergo the mechanical treatments and the addition of EDTA . Thus, the collagenase Vibro Alginoliticus could be an option to non-surgical therapy of fibroproliferative diseases of the bands

Questo lavoro si prefigge di evidenziare il massivo potenziale dell’impiego delle biotecnologie nella medicina traslazionale. La tesi è tripartita sulla base delle tre distinte ricerche in essa illustrate: ciascuna di esse è caratterizzata dall’utilizzo di approcci biotecnologici differenti. La prima ricerca ha come scopo il confronto in vitro del potenziale osteogenico di cellule staminali mesenchimali prelevate da midollo osseo (hBMSCs) e da tessuto adiposo (hASCs). Ancora, la ricerca si prefigge di valutare in vitro la capacità di due DBM (TBM e DBX) di stimolare il differenziamento in senso osteogenico di due popolazioni di cellule staminali (hBMSCs e hASCs). Le cellule mesenchimali staminali prelevate dal tessuto adiposo (Liposuzione Addominale) e dal midollo osseo (Artroprotesi D’anca), sono state coltivate in un Scaffold a base di osso bovino (Orthoss), in presenza di terreno non differenziativo con l’aggiunta di TBM e DBX. In tal modo, sono stati ottenuti 4 diversi gruppi cellulari. Dopo 28 giorni di incubazione, sono stati effettuati i test MTT (vitalità cellulare) e RT-PCR per la variazione dell’espressione genica di Osteopontina, Osteocalcina, Osteonectina e Collagena I. I test MTT hanno dimostrato una maggiore vitalità cellulare delle cellule coltivate con il TBM rispetto alle cellule coltivate con il DBX e nessuna differenza significativa tra i due tipi di cellule mesenchimali. I risultati suddetti sono stati confermati anche con la RT-PCR, in cui si nota un aumento dell’espressione genica dei geni dell’ Osteopontina, Osteocalcina, Osteonectina e Collagene I in quelle cellule coltivate con il TBM rispetto alle cellule coltivate con il DBX e nessuna differenza significativa tra i due tipi di cellule mesenchimali. Alla luce di ciò, è possibile asserire che i risultati hanno dimostrato l’assenza di una differenza significativa nel potenziale osteogenico delle cellule mesenchimali prelevate dal tessuto adiposo e midollo osseo; si è, inoltre, evidenziate che tra le due DBM analizzate il TBM risulta essere migliore rispetto al DBX sia come capacità differenziativa che come sopravvivenza cellulare. La seconda ricerca si basa sullo studio delle applicazione del laser a diodi nell’infiammazione e rigenerazione gengivale, utilizzando bassi livelli di potenze ( Low Level Laser Terapy). Lo scopo di questa ricerca è stato quello di creare un protocollo clinico da poter utilizzare in ambito odontoiatrico. Fibroblasti gengivali umani sono stati isolati da tessuto connettivo gengivale umano, piastrati in multiwell e biomateriale HYAFF a base di acido ialuronico e irradiate con il laser a diodi a diverse potenze (1 W- 24 mW) e a diverso minutaggio ( 10 minuti-75sec). A fine giornata, a 24 e a 48 ore sono stati effettuati i test MTT (vitalità cellulare) e RT-PCR per la variazione dell’espressione genica dei geni del Collagene I e della Fibronectina. Dai test MTT risulta che le cellule trattate con il laser - con una potenza che varia tra i 24 mW e 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec - esprimono una vitalità cellulare maggiore rispetto ai CTRL. Tali risultati sono stati confermati anche dalla RT-PCR, in cui si nota un aumento dell’espressione genica dei geni del Collagene I e della Fibronectina di quelle cellule irradiate con una potenza che varia tra i 24 mW e i 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec. Conseguentemente, è possibile sostenere che un protocollo clinico che potrebbe essere utilizzato in ambito odontoiatrico è una bassa potenza che varia tra i 24 mW e i 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec. La terza ricerca si pone l’obiettivo di studiare in vivo l’effetto della Collagenasi del Vibro Alginoliticus sulla patologia fibroproliferativa della mano Dupuytren. La patologia di Dupuytren è caratterizzata dalla formazione di un cordone fibrotico sull’aponevrosi facciale della mano costituito da Collagene I ma, soprattutto, da Collagene III. I cordoni fibrotici sono stati prelevati in sala operatoria (Aponeverctomia Regionale), trasportati in laboratorio, tagliati a pezzi da 5mm, in ciascuno dei quali sono stati iniettati 20 µl di Collagenasi. Alcuni campioni sono stati sottoposti ad azioni meccaniche di compressioni verticali e distensioni longitudinali; successivamente, in essi sono stati iniettati 20 µl di Collagenasi, altri campioni sono stati trattati con l’aggiunta di 20 µl di EDTA, per la presenza di spot di calcificazioni osservati grazie alla colorazione Azan Mallory e confermati dalla IHC per l’osteopontina. Sono state applicate a 3-6-12-24-30 ore le comuni tecniche istologiche (Azan Mallory, IHC Collage I, Collogene III e Osteopontina). E’ stata utilizzata, inoltre, l’analisi semiquantitativa del Collagene III con il Software Imagej. Le analisi istologiche hanno dimostrato una riduzione del Collagene I e III in tutti i campioni trattati con Collagenasi e lo scioglimento dei nuclei di calcificazione in quei campioni trattati con EDTA. L’analisi semiquantitativa del Collagene III ha mostrato una diminuzione progressiva del segnale del Collagene III a intervalli temporali crescenti e un aumento dell’efficacia dell’utilizzo della Collagenasi se i campioni subiscono dei trattamenti meccanici e l’aggiunta di EDTA. Quindi, la Collagenasi del Vibro Alginoliticus potrebbe essere un’opzione alla terapia non chirurgica delle malattie fibroproliferative delle fasce