Tyrosine hydroxylase and HSPB8 interact with the prion protein

The prion protein (PrP) is currently one of the most studied molecules in the neurosciences as it causes a group of neurological diseases collectively named transmissible spongiform encephalophaties (TSEs). The TSEs are characterized by a variety of motor and/or cognitive symptoms distinct from those of Parkinson and Alzheimer diseases and severely affect both humans and a variety of mammals. A great effort has thus been made to understand the molecular basis of PrP activity, both in physiological and pathological terms. In this context, the identification of neuronally-relevant interactors of PrP, capable of governing or interfering with its activity, cellular localization and/or expression, plays a crucial role. Through the expression of the proteins of interest in recombinant form in E.coli cells and the analysis of their interaction by Western blot and dot-blot, we identified two specific and neurologically relevant interactions involving the prion protein and on the one hand tyrosine hydroxylase, the enzyme that catalyzes the initial and rate-limiting reaction of the biosynthesis of catecholamines dopamine, norepinephrine and epinephrine; on the other hand the heat shock protein B8, member of the small heat shock protein family that appears to play an important role in those diseases that, like transmissible spongiform encephalopathies, are characterized by the accumulation of misfolded proteins. The association/dissociation constants of the complexes have been calculated using surface plasmon resonance and interactions were confirmed by immunohistochemistry. The data obtained show a specific and high affinity interaction (KD in the nano molar range) between the TH N-terminal regulatory domain (1-152) and the C-terminal structured domain (90-230) of PrP. The co-expression of the two proteins causes a shift in prion protein expression from a prevalent membrane-associated expression to a greater cytoplasmic localization, and also a down-regulation of the levels of expression of the prion protein without, however, affecting the topology and expression of tyrosine hydroxylase. The link between PrP and HSPB8 involves the C-terminal domain of the prion protein and the co-expression of the two proteins leads to a down-regulation of both prion protein and HSPB8. The latter, moreover, protects the prion protein from degradation by Proteinase K, while it seems to accelerate the thermal denaturation. The mutants K141E and K141N of the heat shock protein, associated with the development of neuropathy, show minor binding affinity with respect to the wild type protein and they are less effective in regulating the levels of expression, localization and degradation of the prion protein. Our results, in particular if confirmed in pathological patterns, can help to understand the physiological and pathological mechanisms of action of the prion protein and suggest tyrosine hydroxylase and heat shock protein B8 as prion protein modulators, thus as potential targets for therapeutic applications.

La proteina prionica è, ad oggi, una delle molecole più studiate nelle neuroscienze poiché essa rappresenta l’agente eziologico di un gruppo di patologie neurologiche chiamate collettivamente encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Queste patologie sono caratterizzate da una serie di sintomi motori e cognitivi distinti da quelli delle patologie di Parkinson e Alzheimer e colpiscono l’uomo e una grande varietà di mammiferi. Per tale ragione un grande sforzo è stato fatto per capire le basi molecolari dell’attività di PrP in condizioni fisiologiche e patologiche, le quali, tutt’ora, non sono del tutto comprese. In questo contesto è di cruciale importanza l’identificazione di nuovi partner di legame che regolino o interferiscano con l’attività, la localizzazione cellulare e/o l’espressione della proteina prionica. Tramite l’espressione delle proteine di interesse in forma ricombinante in cellule di E.coli e l’analisi delle loro interazioni mediante Western blot e dot-blot, abbiamo identificato due interazioni specifiche e neurologicamente rilevanti della proteina prionica coinvolgenti da un lato la tirosina idrossilasi, enzima che catalizza la reazione iniziale e limitante della biosintesi delle catecolamine dopamina, norepinefrina ed epinefrina; dall’altro l’heat shock protein B8, membro della famiglia delle small heat shock protein, che sembra ricoprire un ruolo particolarmente importante in quelle patologie che, come le encefalopatie spongiformi trasmissibili, sono caratterizzate dall’accumulo di proteine mal ripiegate. Le costanti di associazione/dissociazione dei complessi sono state calcolate mediante surface plasmon resonance e le interazioni sono state confermate tramite immunoistochimica. I dati ottenuti evidenziano un’interazione specifica e ad alta affinità (KD nel range nM) tra il dominio regolatorio N-terminale (1-152) di TH e il dominio strutturato C-terminale (90-230) di PrP. La co-espressione delle due proteine causa sia uno spostamento da un’espressione prevalentemente di membrana della proteina prionica ad una localizzazione maggiormente citoplasmatica, sia una down-regolazione dei livelli di espressione di proteina prionica senza, tuttavia, influenzare topologia ed espressione della tirosina idrossilasi. Il legame tra PrP e HSPB8 coinvolge il dominio C-terminale della proteina prionica e la co-espressione delle due proteine porta ad una down-regolazione sia di proteina prionica che di HSPB8. Quest’ultima, inoltre, protegge la proteina prionica dalla degradazione da parte di proteinasi K, mentre sembra favorirne la denaturazione termica. I mutanti K141E e K141N dell’heat shock protein, associati allo sviluppo di neuropatie, mostrano affinità di binding minori rispetto alla proteina wild type così come sono meno efficaci nel regolare i livelli di espressione, localizzazione e degradazione della proteina prionica. I nostri risultati, in particolare se confermati in modelli di patologia, possono aiutare a comprendere i meccanismi d’azione fisiologici e patologici della proteina prionica e indicano tirosina idrossilasi e heat shock protein B8 come modulatori della proteina prionica stessa e quindi come potenziali target per applicazioni terapeutiche.