Identification and functional characterization of human cytomegalovirus Surface exposed glycoproteins

The reverse vaccinology approach to the human cytomegalovirus (HCMV) genome, one of the largest known mammalian viral genome with a coding potential of more than 166 proteins, led to the identification of 94 potential membrane-associated or secreted proteins. Many of the selected proteins have no assigned functions but share a high degree of conservation among different strains. These designed ORFs have been synthesized as eukaryotic codon-optimized sequences in frame with both hexa-histidine tail and c-myc tag coding elements. A more detailed analysis was performed on a certain number of these tagged proteins in both epithelial and fibroblast human derived cell lines, natural targets of HCMV. As starting point 12 hCMV proteins with antigenic properties were chosen for further characterization in terms of structural and functional features. This work was aimed to the identification and functional characterization of two new HCMV surface exposed glycoproteins. The study is divided in two parts: first the identification and characterization of ORFX*; second the identification and characterization of a novel HCMV Fc binding protein. Regarding the first part, we focused our attention on ORFX gene product, a putative ORF identified by in silico analysis. Biochemical analysis on both ORFX viral protein product or transient expressed single gene allowed us to conclude that ORFX is: a) heavily glycosylated protein; b) expressed as late product during infection; c) present in the assembly complex, the cellular site of virus assembly; d) present on the HCMV virion envelope and e) secreted in transient expression as by in silico prediction. These observations led us to search for ORFX partners among other HCMV envelope exposed glycoproteins. We found that gH was efficiently transported to plasma membrane only when coexpressed with ORFX. Moreover, co-expression of gH (and gH/gL) with ORFX and coimmunoprecipitation experiments, carried on both transfected and infected cells, showed that ORFX is part of a gH-based complex. These results suggest that ORFX could function as both gH “escort” protein but also be part of a cellular recognizing complex and invite to a deeper analysis of both its functions and immunological properties. Regarding the second part of the study, we were able to identify two novels Fc binding protein coded by CMV: RL12 and RL13. The latter was also further characterized as recombinant protein in terms of cellular localization, Fc binding site and IgG internalization ability. *Names and protein sequences are, actually, under revision of NVD Intellectual property office

Riassunto L’approccio di Reverse vaccinology applicato all’intero genoma del cytomegalovirus umano (HCMV), uno dei genomi più estesi all’interno della famiglia degli herpesviruses umani, ha portato all’identificazione di 94 ORF predette come codificanti per proteine di membrana o proteine secrete. La gran parte delle ORF selezionate non ha alcuna funzione assegnata pur rimanendo altamente conservata in tutti i ceppi conosciuti di HCMV. Tali ORF sono state inserite in vettori d’espressione eucariotici aggiungendovi una porzione C-terminale codificante per i tags His e myc. L’ analisi dettagliata riguardante le proprietà antigeniche dei prodotti proteici derivanti dalla trasfezione in cellule epiteliali e fibroblasti umane dei plasmidi in questione ha prodotto la selezione di 12 proteine virali. Questo lavoro di tesi è stato incentrato sull’ identificazione e caratterizzazione funzionale di due nuove glicoproteine presenti sulla membrana esterna di HCMV. Lo studio è diviso in due parti: in prima analisi, l’identificazione e la caratterizzazione di ORFX*; in seconda analisi l’identificazione e caratterizzazione di RL13 come Fc binding protein. Riguardo la prima parte del lavoro, l’attenzione è stata focalizzata sul prodotto genico di ORFX inzialmente identificata solo attraverso analisi in silico. Analisi biochimiche su ORFX prodotta in infezione e talvolta in trasfezione di cellule umane hanno portato i seguenti risultati: 1) ORFX è una proteina estesamente glicosilata 2) Vene prodotta nelle fasi tardive di espressione lungo il ciclo di replicazione virale, 3) è presente nel sito di assemblaggio virale (Assembly complex) in cellule infettate da HCMV, 3) è esposta sulla sua membrana esterna del virus,4) Viene secreta dalle cellule che la esprimono in maniera transiente come da predizioni. Queste osservazioni ci hanno guidato verso l’idea di cercare dei possibili partner proteici tra quelli conosciuti come presenti sull’envelope esterno virale. A tal proposito abbiamo riscontrato che gH veniva trasportato nella membrana plasmatica cellulare solo quando co-espressa con ORFX e viceversa. La Co-immunoprecipitazione di ORFX e gH da lisati di cellule infettate e trasfettate con i singoli geni ha rivelato la diretta interazione tra le due proteine identificando ORFX come parte di un complesso “gH based”. Questi risultati delineano un ipotetica funzione di ORFX come proteina potenzialmente implicata nell’ “escort” di gH e talvolta parte di un complesso virale possibilmente riconosciuto dall’host. Riguardo la seconda parte del lavoro di tesi, i risultati sono riguardanti l’identificazione due nuove “Fc binding proteins” codificate da HCMV :RL 12 e RL13. Quest’ultima è stata sottoposta a caratterizzazione biochimica nella sua forma ricombinante in termini di localizzazione intracellulare, studio del sito di legame per le Fc e abilità della proteina a promuovere l’internalizzazione cellulare delle IgG nel contesto dei meccanismi virali di immuno-evasione. *Nomi e sequenze proteiche sono attualmente sotto la revisione dell’ufficio brevetti NVD