The adjuvant MF59 induces ATP release from muscle that potentiates response to vaccination

Vaccines are the most effective agents to control infections [1]. In addition to the pathogen antigens, vaccines contain adjuvants that are used to enhance the specific immune responses. Despite their effectiveness and their wide use, the mechanism of action of many adjuvants is poorly characterized [2]. Therefore, adjuvant research is crucial to better understand how they work and to exploit their full potential in vaccinology [3]. Release of endogenous danger signals has been linked to adjuvanticity, however the role of extracellular ATP during vaccination has never been explored. Extracellular ATP can work as "danger signal" and, as such is a strong modulator of immune responses [4-6]. Here, we tested whether ATP release is involved in the immune boosting effect of four common adjuvants: aluminium hydroxide, calcium phosphate (CaPi), incomplete Freund’s adjuvant (IFA) and the squalene-based oil in water emulsion MF59. Experiments were performed ex vivo in excised mice muscles (tibialis anterior and quadriceps) and in vivo in live mice injected with the reporter system luciferase-luciferin that reports on ATP changes. We found that intramuscular injection in general is always associated to a weak transient release of ATP. In contrast, a greatly enhanced ATP release was found upon injection of MF59 but not by all other adjuvants tested. Therefore, we wanted to dissect whether and how ATP release would contribute to the activity of MF59. The strong adjuvanticity of MF59 [7-8] has been ascribed to its capability to induce an immunocompetent environment in the muscle, characterized by a rapid and transient influx of a large number of immune cells participating in antigen uptake and transport to draining lymph nodes [9-11]. We found that the local injection of apyrase, an ATP-hydrolyzing enzyme, reduced the immune cells recruitment induced by MF59 but not by alum or IFA. These findings indicated that the ability of MF59 to induce migration of different immune cells into the injected muscle is partly due to induced ATP release. Moreover, co-injection of apyrase and MF59 at the muscle injection site reduces the number of antigen positive cells in the draining lymph nodes in a cell type-specific manner. Indeed, co-injection of apyrase negatively impacts the number of antigen positive B cells induced by MF59, suggesting that B cells could be a key component in ATP-mediated signaling during vaccination. Strong innate immune responses lead to enhanced adaptive immune responses [12]. Accordingly, we compared the impact of MF59-induced ATP release on T cells responses and antibody titers. Groups of mice were immunized with an experimental trivalent influenza vaccine (TIV) either as plain antigens or together with MF59 with or without apyrase. Apyrase strongly inhibited influenza specific T cell responses, total IgG and hemagglutination inhibition titers in response to an MF59-adjuvanted trivalent influenza vaccine. These data demonstrate that a transient ATP release is required for innate and adaptive immune responses induced by MF59 and link for the first time extracellular ATP to an enhanced response to vaccination.

I vaccini rappresentano senza dubbio l’arma più efficace per combattere e tenere sotto controllo le infezioni [1]. In aggiunta agli antigeni del patogeno, i vaccini contengono adiuvanti utilizzati per potenziare le risposte immunitarie specifiche verso determinati antigeni. Nonostante la loro efficacia e il loro largo uso, il meccanismo di azione di molti adiuvanti è ancora scarsamente caratterizzato [2]. Pertanto, far luce sui meccanismi d’azione degli adiuvanti vaccinali è fondamentale per sviluppare prodotti nuovi, più efficienti e sicuri, e poter così sfruttare appieno il potenziale della vaccinologia [3]. Dopo la vaccinazione, è stato osservato al sito di iniezione il rilascio locale di molecole endogene con la capacità di segnalare “danno” al sistema immunitario, note come allarmine. Per esempio, un rilascio locale di acido urico e DNA è stato osservato nel modello murino dopo vaccinazione con alum, il più diffuso tra gli adiuvanti approvati per uso sull’uomo. Tuttavia, finora non è mai stato esplorato un potenziale ruolo dell’ATP durante la vaccinazione. L’ATP, tra le sue tante funzioni, quando rilasciato nell’ambiente extracellulare in concentrazioni opportune può fungere da allarmina e, come tale è un forte modulatore delle risposte immunitarie [4-6]. Pertanto, in questo lavoro abbiamo indagato se un rilascio di ATP è coinvolto nel meccanismo d’azione di quattro comuni adiuvanti vaccinali: idrossido di alluminio (alum), calcio fosfato (CaPi), adiuvante incompleto di Freund (IFA) e MF59. Sono stati condotti esperimenti ex vivo su muscoli murini isolati (tibiale anteriore e quadricipite) e in vivo in topi immunizzati intramuscolo con l’adiuvante da testare e il sistema reporter luciferina-luciferasi in grado di segnalare il livello di ATP al sito d’iniezione. Abbiamo osservato che l'iniezione intramuscolare è sempre associata a un debole e transitorio rilascio di ATP. Il rilascio basale di ATP è notevolmente potenziato dall’iniezione di MF59 ma non dagli altri adiuvanti testati. Pertanto, abbiamo esplorato se e come il rapido e transitorio rilascio di ATP indotto da MF59 al sito d’iniezione potesse contribuire al suo meccanismo d’azione. Il forte potere adiuvante di MF59 [7, 8] è stato attribuito alla sua capacità di istituire un ambiente immunocompetente al sito di iniezione nel muscolo, caratterizzato da un rapido e transitorio afflusso di un gran numero di cellule immunitarie che captano e assorbono l’antigene e lo trasportano ai linfonodi drenanti [9-11]. Abbiamo qui dimostrato, che la co-iniezione di apirasi, un enzima in grado di idrolizzare l’ATP, riduce fortemente l’afflusso di cellule immunitarie indotto da MF59 ma non quello indotto da alum o IFA. Questi risultati indicano che l’abilità di MF59 di indurre un forte afflusso di cellule immunitarie al sito di iniezione è in parte dovuta alla sua intrinseca capacità di rilasciare ATP. Inoltre, abbiamo osservato che la co-iniezione di apirasi e MF59 riduce il numero di cellule antigene-positive che dal muscolo raggiungono i linfonodi drenanti. Tale riduzione si è rivelata tipo cellulare-specifica, infatti il trattamento con apirasi impatta negativamente il numero di cellule B antigene-positive indotto da MF59 nei linfonodi drenanti, suggerendo che le cellule B potrebbero essere un elemento chiave nei “pathways” mediati da ATP durante la vaccinazione. Efficienti risposte immunitarie di tipo innato si traducono spesso in forti risposte adattative [12]. Pertanto, abbiamo analizzato un eventuale ruolo dell’ATP rilasciato da MF59 sull’attivazione delle cellule T e la produzione di titoli anticorpali antigene-specifici. Di conseguenza, gruppi di topi sono stati immunizzati con un vaccino influenzale trivalente, iniettato come tale o adiuvato con MF59 con o senza apirasi. L’apirasi ha fortemente ridotto la proliferazione delle cellule T vaccino-specifiche e i relativi titoli anticorpali. Questi dati dimostrano che un locale e transitorio rilascio di ATP a livello del sito d’iniezione è necessario per lo sviluppo di risposte immunitarie innate e adattative indotte da MF59 e associano per la prima volta un rilascio extracellulare di ATP a un potenziamento delle risposte immunitarie indotte dalla vaccinazione.