Genomic approach to Idiopathic Calcium Nephrolithiasis: searching for susceptibility genes in a three generation family

Idiopathic calcium nephrolithiasis (ICN) is a multifactorial disease with a pathogenesis depending upon the interplay of environmental, metabolic, anatomical and genetic factors. The importance of hereditary factors in ICN has emerged from a number of studies on families and twins affected by ICN. Computer programs predicted the best inheritance fit with a model of single gene co-dominant model/polygenic model. Most candidate gene or association studies have produced, up to date, negative or only marginal results, leaving the genetic basis of ICN still an open question. But, genetic analysis techniques are rapidly evolving and promise to improve our knowledge of the genetic basis of nephrolithiasis and allied disorders. Whole-genome scanning techniques, like Next-Generation Sequencing (NGS) and CGH (Comparative Genomic Hybridization) array, are the most recent technical approaches of molecular genetics that allow to trace out a complete draw of variation present in the human genome, namely SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) and heterogeneous structural variants. In the last years, indeed, several studies have recognized the critical role of structural genetic variants, mostly represented by Copy-Number Variants (CNVs), in modulating gene expression and complex diseases phenotype. Aim of this project was to identify some of the major susceptibility genes involved in idiopathic calcium nephrolithiasis applying the potential of whole-genome scanning technologies to a case study very peculiar, both for clinical manifestations both for its genetic background. The proband, since 30 years, suffers of a recurrent and severe form of ICN, with intermittent hypercalciuria and phosphaturic tubulopathy, expelling, up to date, about 300 calculi both spontaneously and by lithotripsy (33 treatments). Strikingly, he belongs to a family with consanguinity in which nephrolithiasis is present in several members and is transmitted in an apparently dominant fashion, with males being more severely affected than females. CGH arrays has been performed in the proband and in eight members of the family in order to detect the presence of CNVs in the genome. A duplication of 308 kb region of the Xq22.2 chromosome has been detected in the proband. This CNV resulted particularly interesting because it was a novel (not known) variant and it was shared by other three family members (maternal inheritance). Moreover, matching the Xq22.2 duplication over a database of 14375 individuals only 5 overlapping duplications were found, confirming its extreme rarity. Strikingly, all these 5 duplication shared a common region that corresponded to NUP62CL gene, suggesting a likely importance of this genetic trait. Furthermore, performing an expression study, we observed a significant and marked down-regulation of NUP62CL. Thus, even if we could not have a definitive proof of principle, this Xq22.2 CNV seemed to have an important role for ICN pathogenesis in our family. Nonetheless, given its presence in a member of the family that was not evidently affected and given the severity of the phenotype of some members of the paternal branch, we postulated that additional genetic determinants were also responsible of the severe phenotype encountered in the proband. In this light, we performed whole exome sequencing of the proband to identify rare single nucleotide variants that may have a role as susceptibility variants for ICN in the case-study family. By bioinformatic analyses and molecular validation, we could draw a polygenic model of heredity, with the identification of four possible susceptibility genes: XDH, ATP6V1B1, HNF1B, NUP62CL. The XDH gene, normally responsible of xanthinuria type I, was highlighted for the presence of two very rare variants with a damaging predicted effect on protein. Next, we discovered a missense homozygous variant in ATP6V1B1 gene, whose role is already known in distal tubular acidosis, that seemed to account for the ICN intermediate phenotype hypocitraturia observed in the family. In addition, we found an extremely rare heterozygous variant in HNF1B gene, a causative factor in cystic nephropathy, and the proband, indeed, recently showed pre-calyceal cysts. Strikingly, we again evidenced NUP62CL gene for the presence of two homozygous variants that operate activating criptic splicing sites, thus eventually generating an aberrant mRNA. This gene has never been associated to ICN but, having a known role in oxalate transport, could be responsible of some of the biological mechanisms that are on the basis of ICN pathogenesis

La nefrolitiasi calcica idiopatica (NCI) è una malattia multifattoriale, la cui patogenesi dipende dall’interazione di fattori ambientali, metabolici, anatomici e genetici. L’importanza dei fattori ereditari è emersa da diversi studi su famiglie e gemelli affetti da NCI. Il modello di ereditarietà più probabile sembrerebbe, come predetto da programmi bioinformatica, ad eredità monogenica co-dominante o poligenica. La maggior parte degli studi a gene candidato o di associazione condotti fin ora ha prodotto risultati negativi o marginali, lasciando pertanto le basi genetiche della NCI una questione ancora aperta. Tuttavia, le nuove tecnologie di analisi genetica sono in continua evoluzione e potrebbero contribuire ad approfondire le nostre conoscenze sulla patogenesi della NCI. Le tecnologie whole-genome scanning, quali Next-Generation Sequencing (NGS) and CGH (Comparative Genomic Hybridization) array, rappresentano gli approcci di genetica molecolare più recenti, e permettono di tracciare una mappa completa della variabilità presente nel genoma umano, in particolare SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) e varianti strutturali. Negli ultimi anni l’importanza di queste ultime, maggiormente rappresentate dalle Copy-Number Variants (CNVs), è stata infatti dimostrata in numerosi studi che ne hanno individuato un ruolo critico per lo sviluppo di malattie genetiche complesse. Scopo di questo studio è stata la ricerca di alcune delle maggiori varianti di suscettibilità alla NCI, applicando l’enorme potenziale delle tecnologie whole genome scanning ad un caso studio molto peculiare, sia per manifestazioni cliniche che per il bagkground genetico. Il probando da circa 30 anni è affetto da una forma severa di NCI, con ipercalciuria intermittente e tubulopatia fosfaturica, espellendo fino ad oggi circa 300 calcoli, sia spontaneamente che mediante litotripsia (33 interventi). Egli appartiene ad una famiglia con consanguineità, in cui la nefrolitiasi viene trasmessa in modo apparentemente dominante, con maschi affetti più severamente e meno frequentemente rispetto alle femmine. Da un’analisi CGH array, al fine di individuare la presenza di eventuali CNV, è stato possibile identificare una duplicazione di una regione di 308 Kb del cromosoma X (Xq22.2 CNV) del probando. Questa CNV è risultata particolarmente interessante poiché fin ora mai identificata e condivisa da altri tre familiari (eredità materna). Inoltre, confrontando la duplicazione Xq22.2 con un database di 14375 individui sono state identificate solo 5 duplicazioni “ overlappanti”, confermandone pertanto l’estrema rarità. In particolare, tutte queste 5 duplicazioni mostravano una regione minima comune, corrispondente al gene NUP62CL, suggerendone una possibile significatività. In uno studio di espressione da noi effettuato si è inoltre osservata una significativa e marcata down-regolazione di NUP62CL. Pertanto, pur non avendone avuto prova definitiva, è sembrato che la CNV Xq22.2 giocasse un ruolo importante nella patogenesi della NCI nella nostra famiglia. Tuttavia, data la sua presenza anche in un membro non evidentemente affetto e considerata anche la severità del fenotipo NCI di alcuni membri del ramo paterno, è stato ipotizzato che la presenza aggiuntiva di altri determinanti genetici potesse essere responsabile del fenotipo estremo riscontrato nel probando. In quest’ottica, è stato sequenziato l’intero esoma del probando (Whole Exome Sequencing) al fine di individuare varianti puntiformi rare che potessero agire da ulteriori varianti di suscettibilità alla NCI nella famiglia caso studio. La fase di analisi bioinformatica e validazione molecolare ha portato a delineare un quadro di eredità poligenica, con l’individuazione di quattro possibili geni di suscettibilità: XDH, ATP6V1B1, HNF1B, NUP62CL. Il gene XDH, fattore causativo della xanthinuria di tipo I, è stato evidenziato per la presenza di due varianti rare con un predetto effetto dannoso sulla struttura proteica. Il gene ATP6V1B1, di cui è già noto il ruolo nell’acidosi tubulare distale, presentava una variante missenso che sembrava render conto del fenotipo intermedio ipocitraturia osservato nella famiglia. E’ stata individuata, inoltre, una variante estremamente rara nel gene HNF1B, un fattore causativo di nefropatia cistica e, concordemente, il probando recentemente aveva mostrato la presenza di cisti pre-caliceali. Infine, soprendentemente, è stato possibile evidenziare ancora una volta il gene NUP62CL per la presenza di due varianti omozigoti, che agiscono attivando dei siti criptici di splicing e quindi con un probabile effetto di produzione di un mRNA aberrante. Questo gene non è stato mai associato alla NCI ma, possedendo un ruolo noto nel trasporto dell’ossalato, potrebbe essere responsabile di alcuni dei meccanismi che sottendono alla patogenesi della NCI