Optimization of light use efficiency in Nannochloropsis for biodiesel production

At present energy demand is largely fulfilled by fossil fuels, and it is easy to suppose that also in next decades they will still provide a large fraction of the energy supply. Since oil reserves are finite and the cost for its extraction will continuously raise, it is necessary to find alternatives source of energy. Renewable energy sources represent a good solution to the energy-problem and for this reason they are receiving a strong attention from industry and research centers. Photosynthetic organisms can represent a promising alternative to oil because they can be exploited for the production of different molecules exploitable as fuels such as ethanol, hydrogen and lipids. Fuels produced exploiting living organisms are called biofuels. Currently most of biofuel from photosynthetic organisms, is obtained by plant crops which present many limitations like the seasonality production and a low oil fraction that constitutes only 5% of the biomass. To overcome this limitation, an interesting alternative is the exploitation of photosynthetic microrganisms such as microalgae. Some algae species have, in fact, the ability of accumulating large amount of lipids within their cells which can be exploited as feedstock for the production of biodiesel. Microalgae is a wide group comprehending thousand of different algae species, so one fundamental step is the choice of a suitable organism. A suitable candidate should have a fast growth rate in a large range of light intensities and the ability to accumulate large amount of lipids. Although there is no ideal organism which will be suitable for all, we focused on the seawater alga Nannochloropsis gaditana. The general aim of this work is to investigate photosynthetic apparatus of Nannochloropsis gaditana in order optimize the light use efficiency in this microalga to increase the productivity. In fact, as wide describe in the second chapter, light provides the energy supporting algae metabolism and consequently lipids production. Then available radiation must be exploited with the highest possible efficiency to optimize productivity and make microalgae large scale cultivation energetically and economically sustainable. In this chapter the molecular and the factors influencing light use efficiency in algal biomass production bases were investigated. Moreover exempla focused on how algae genetic engineering and control of light environment within photobioreactors can improve the productivity of large scale cultivation systems were given. In the third chapter photosynthetic apparatus of Nannochloropsis was studied. Nannochloropsis's photosynthetic apparatus is characterized by the presence of only chlorophyll a, with violaxanthin and vaucheriaxanthin esters as the most abundant carotenoids. The photosynthetic apparatus was analyzed by purifying the thylakoids and isolating the different pigment-binding complexes upon mild solubilization. The results from the biochemical and spectroscopic characterization showed that the photosystem II antenna is loosely bound to the reaction center, whereas the association is stronger in photosystem I, with the antenna-reaction center super-complexes surviving purification. Such a supramolecular organization was found to be conserved in photosystem I from several other photosynthetic eukaryotes, even though these taxa are evolutionarily distant. Obtained result suggests the presence of a selective advantage for a stable antenna (called VCP, Violaxanthin Chlorophyll binding Protein) and core complex association in the case of PSI but not in the case of PSII. A possible explanation was done considering that PSII supercomplexes are involved in several regulatory mechanisms which require a flexible binding of the antenna complexes to the reaction center along with the possibility of modulating this association according to environmental stimuli. On the contrary PSI reaction center is known to be stable with regard to light stress and to undergo a very low turnover although the PSI antenna have also shown to experience some regulation, the present knowledge suggests that the mechanisms affecting PSI antennae are less extensive and do not require the continuous modulation of its interactions with PSI and are thus compatible with a stronger association with the reaction center. After having investigated photosynthetic apparatus of Nannochloropsis, in the fourth chapter, sequences and proteomic analysis on antenna protein were studied. A phylogenetic analysis of LHC sequences, identified in Nannochloropsis genome, allowed their classification into six different subgroups of antenna proteins. The preliminary proteomic analysis on different sucrose gradients fractions corresponding to antenna proteins, PSI and PSII fraction showed the existence of specific antenna proteins bound to PSI forming PSI-supercomplex. In fifth chapter we focused out attention on different strategies for the biotecnological optimization of Nannochloropsis strain. Despite the fact that Nannochloropsis is considered the model organism for the production of biofuels, tools for the genetic manipulation of this species are still under development and only recently a few genome sequences become available, making possible to design specific protocol for the biotechnological improvement of this microalga. In this chapter two different methods, homologous recombination transformation and random mutagenesis, were applied on Nannochloropsis to generate and isolate possible valuable mutants. Obtained results highlighted that Nannochloropsis is not able to perform homologous recombination with high efficiency and chemical mutagenesis, is now, a more valuable methods to manipulate Nannochloropsis strain. Photosynthesis is a complex phenomenon which is finely tuned according to environmental conditions which are far from being completely understood. This understanding is also seminal in the perspective of algae biofuels production in order to make genetic manipulation efforts more effective. One of the main target in this field is the xanthophyll cycle, a photoprotection mechanism which is activated under strong irradiation, present in most photosynthetic eukaryotes including Nannochloropsis. In the sixth chapter was investigated a possible further level of regulation, depending from the redox state, of this cycle. The study was performed on A. thaliana VDE N-terminal domain enriched in cysteines, but as demonstrated in the chapter, residues analyzed are well conserved in all other species and thus all conclusions are most likely valid for Nannochloropsis protein as well. Results revealed that cysteines are fundamental for VDE enzymatic active and all of these residue, except one, are involved in disulfide bridge. Redox titration showed a steep dependence from redox potential of protein activity, drawing a scenario where redox regulation is not suitable for a fine tuning of VDE activity. In appendix 1 isolated Violaxanthin Chlorophyll binding Protein (VCP) was studied thanks to advanced EPR techniques in order to investigate the presence of the photoprotective mechanism based on triplet-triplet energy transfer (TTET). Results of the data showed a strong similarity in terms of triplet state populations between VCP, FCP from diatoms and LHC-II from higher plants. Even if these antenna proteins have differentiated sequences and binds different pigments, the results suggest that in all members of the LHC superfamily there is a core represented by two central carotenoids surrounded by five Chlorophyll a molecules. This conserved structural organization plays a fundamental photo-protective function in Chl triplets quenching.  

Attualmente la richiesta mondiale di energia viene in gran parte soddisfatta utilizzando combustibili fossili, primo tra tutti il petrolio. Nonostante sia facile supporre che anche nei prossimi decenni la produzione energetica derivante da fonti fossili sarà preponderante, già ora sono necessarie delle alternative: le riserve di petrolio sono limitate ed i costi di estrazione sono in continua crescita. Le fonti energetiche rinnovabili rappresentano una buona soluzione al problema energetico e per questo motivo stanno ricevendo una forte attenzione da parte dell'industria e dei centri di ricerca. Esistono diverse fonti di energia rinnovabile, tra queste gli organismi fotosintetici possono rappresentare un'alternativa promettente perché possono essere sfruttati per la produzione di diverse molecole utilizzabili come combustibili potendo generare etanolo, idrogeno e lipidi. I combustibili prodotti utilizzando organismi viventi sono chiamati biocarburanti e per la maggior parte sono ottenuti da coltivazioni di piante oleaginose come la soia, la palma e la colza. Queste coltivazioni tuttavia presentano anche molti lati negativi sia perché la loro produzione è esclusivamente stagionale sia perché il loro contenuto lipidico è pari al 5% della biomassa totale il che abbassa notevolmente la redditività di queste coltivazioni. È possibile superare queste limitazioni sfruttando altri tipi di microrganismi fotosintetici come microalghe. Alcune specie di alghe hanno, infatti , la capacità di accumulare grandi quantità di lipidi al loro interno e tali lipidi possono essere impiegati come materia prima per la produzione di biodiesel. Le microalghe sono gruppo molto vasto comprendente migliaia di differenti specie: la scelta dell’organismo adatto è un passo fondamentale. La microalga ideale dovrebbe essere capace di mantenere un elevato tasso di crescita sotto differenti intensità luminose ed avere la capacità di accumulare elevate quantità di lipidi. Parte di queste caratteristiche ideali sono state rilevate in Nannochloropsis gaditana, una microalga marina, diventata, non solo per il nostro gruppo di ricerca, l'organismo modello per il biodiesel. L'obiettivo generale di questo lavoro è indagare l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis gaditana per ottimizzare l'efficienza nell'utilizzo della luce al fine di aumentare la produttività di lipidi. Infatti, come ampiamente descritto nel secondo capitolo, la luce fornisce l'energia a sostegno del metabolismo delle alghe e, di conseguenza, supporta anche la produzione di lipidi. Quindi l'energia luminosa disponibile deve essere sfruttata con la massima efficienza possibile per ottimizzare la produttività e rendere la coltivazione di microalghe su larga scala energeticamente ed economicamente sostenibile all’interno di fotobioreattori. In questo capitolo sono state studiate le basi molecolari e i fattori che influenzano l'efficienza della luce e il suo utilizzo per la produzione di biomassa. Vengono inoltre forniti esempi di come sia possibile migliorare la produttività nei fotobioreattori lavorando in modo sinergico sia a livello biotecnologico, modificando geneticamente l'organismo, sia a livello ingegneristico con il miglioramento del design del fotobioreattore e con il controllo della luce all'interno dello stesso. Nel terzo capitolo, viene studiato in dettaglio l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis, il quale risulta caratterizzato dalla presenza della sola clorofilla a, mentre violaxantina e vaucheriaxanthina-estere sono invece i carotenoidi più abbondanti. L'apparato fotosintetico è stato analizzato purificando i tilacoidi e isolando i diversi complessi attraverso una blanda solubilizzazione. I risultati della caratterizzazione biochimica e spettroscopica hanno dimostrato che le antenne (chiamate VCP, Violaxanthin Chlorophyll binding Protein) del fotosistema II (PSII) sono debolmente legate al centro di reazione, mentre questa associazione risulta più forte nel caso del fotosistema I (PSI), dove i supercomplessi centro di reazione-antenne non vengono intaccati dalla purificazione. Questo tipo di organizzazione del fotosistema I non è presente solo in Nannochloropsis, ma risulta essere conservata anche in diversi altri eucarioti fotosintetici, anche se questi taxa sono evolutivamente distanti. Il risultato ottenuto suggerisce una forte pressione evolutiva per la presenza di un'associazione stabile tra il complessi antenna e il centro di reazione nel caso di PSI ma non nel caso di PSII. Una possibile spiegazione viene data dal fatto che il PSII è coinvolto in diversi meccanismi regolatori che richiedono un legame flessibile tra complessi antenna e il centro di reazione, lasciando quindi la possibilità di modulare questa associazione secondo gli stimoli ambientali. Il centro di reazione del PSI, al contrario, si caratterizza per essere stabile per quanto riguarda lo stress da alta luce e subire un turnover molto basso. Nonostante sia stato dimostrato che anche il complesso antenna del PSI subisce delle forme di regolazione in presenza di stimoli ambientali molto forti, le attuali conoscenze suggeriscono che i meccanismi che incidono sui complessi antenna del PSI siano meno invasivi rispetto a quelli del PSII e non richiedano la continua modulazione della sua interazione con il centro di reazione del PSI e siano quindi compatibili con una forte associazione con il centro di reazione. Dopo aver indagato l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis, nel quarto capitolo, sono state studiate le sequenze delle proteine antenna ed è stata fatta un'analisi del proteoma dei complessi antenna, del PSI e del PSII. L'analisi filogenetica delle sequenze antenna, identificate nel genoma di Nannochloropsis, ha permesso la loro classificazione in sei diversi sottogruppi. L' analisi preliminare del proteoma ha evidenziato l'esistenza di specifiche proteine antenna legate al PSI che formano i supercomplessi del PSI. Il quinto capitolo è dedicato alle diverse strategie impiegate per l'ottimizzazione biotecnologica di Nannochloropsis. Nonostante Nannochloropsis sia considerato l'organismo modello per la produzione di biocarburanti, i protocolli per la manipolazione genetica di questa specie sono ancora in via sviluppo e solo recentemente sono state rese note le sequenze del genoma, rendendo possibile progettare protocolli specifici per il miglioramento biotecnologico di questa microalga. In questo capitolo sono stati testati due metodi differenti, la ricombinazione omologa e la mutagenesi chimica, su colture di Nannochloropsis per generare e isolare possibili mutanti. I risultati ottenuti hanno evidenziato che Nannochloropsis non è in grado di effettuare la ricombinazione omologa con alta efficienza e la mutagenesi chimica, rappresenta per ora il metodo più efficace per migliorare i ceppi di Nannochloropsis. La fotosintesi è un fenomeno complesso, finemente regolato sulla base delle condizioni ambientali e ben lungi dall'essere completamente compreso. Tale comprensione è però fondamentale nella prospettiva della produzione di biocarburanti da alghe al fine di rendere le strategie di manipolazione genetica più efficaci. Uno dei target principali in questo campo è il ciclo delle xantofille, un meccanismo di fotoprotezione che viene attivato in condizioni di forte illuminazione, presente nella maggior parte eucarioti foto sintetici, compresa Nannochloropsis. Nel sesto capitolo viene considerata l'ipotesi che questo meccanismo sia regolato in base allo stato redox. Lo studio è stato eseguito sul dominio N-terminale ricco in cisteine della VDE di A. thaliana; com'è dimostrato nel capitolo, i residui analizzati sono ben conservati in tutte le altre specie e quindi le conclusioni tratte sono molto probabilmente valide anche per la VDE di Nannochloropsis. I risultati hanno rivelato che le cisteine sono fondamentali per l'attività enzimatica della VDE e tutti questi residui, tranne uno, sono coinvolti in ponti disolfuro. La titolazione redox, inoltre, ha mostrato una forte dipendenza dell'attività dal potenziale redox, disegnando uno scenario in cui la regolamentazione redox non risulta particolarmente adatta per una fine regolazione dell'attività della VDE. Nell'appendice 1, le tecniche avanzate di EPR sono state impiegate al fine di indagare la presenza del meccanismo fotoprotettivo basato su triplet-triplet energy transfer (TTET) nelle antenne (VCP) di Nannochloropsis. I risultati ottenuti mostrano una forte somiglianza in termini di popolazione dello stato di tripletto tra VCP, FCP di diatomee e LHCII di piante superiori. Nonostante queste proteine antenna abbiano sequenze diverse e leghino pigmenti differenti, i risultati suggeriscono che in tutti i membri della superfamiglia LHC sussiste un core costituito da due carotenoidi, il quale è circondato da cinque molecole di clorofilla a. Questa organizzazione strutturale conservata gioca una particolare funzione fotoprotettiva fondamentale nel quenching dei tripletti di Chl.