Ruolo dell'attività spontanea nella formazione dei circuiti neurali del bulbo olfattivo e nell' elaborazione dell'informazione sensoriale

The mammalian central nervous system relies on precise synaptic connections to function correctly. The development of precise neuronal circuitry is regulated by axon guidance molecules as well as by specific pattern of activity between the pre and the post synaptic elements. In this thesis I focused on activity dependent mechanisms, and we analyzed the role of spontaneous afferent activity in the topographic organization of the olfactory bulb. To address this point we analyzed the intrabulbar connections between isofunctional glomeruli in a line of mice genetically modified to have very little spontaneous afferent activity due to the overexpression of the inward rectifying potassium channel Kir2.1 in the olfactory sensory neurons (Yu et al., 2004). Since previous studies were limited to adults (Bellusio et al., 2002; Lodovichi et al., 2003), we first defined the development of the intrabulbar projections between isofunctional glomeruli at early stages of development in control mice. Targeting focal tracer injections to the glomerular layer, we found that the intrabulbar projection is present as early as P7 and it is targeted between homologous glomeruli. However, at this early stage of development, the projection is not confined exclusively to the homologous glomerulus but larger. We found that the connections undergo a refinement process between P15 and P30, when they reach the mature organization of a point to point projection. We then analyzed the formation and the specific targeting of the intrabulbar link in animals with reduced spontaneous activity, i.e. Kir 2.1 mice. We found that the connections are preserved in these mice, but are not exclusively confined to the homologous glomeruli. The link remains larger than in control mice at all the ages tested, from postnatal day 30 to 70, due to the lack of developmental refinement. We then assess the effects of the unrefined connectivity of the bulbar circuits on olfactory behaviour using a classical behavioral test designed to assess the ability to discriminate between two different odorants. We found that Kir 2.1 mice were hampered in discriminating odorants that elicit similar spatial patterns of activated glomeruli (functional maps), such enantiomers, while retaining the ability to discriminate odorants that activate very distinct spatial pattern of glomeruli . Spontaneous activity is thought to play a prominent role in circuit formation at very early stages of development. Once sensory systems become responsive to sensory stimuli, evoked activity contributes to the stabilization and further refinement of neuronal connections. It has been clearly demonstrated that sensory experience often modulates the development of neuronal circuitry within a defined period of time (critical period) in which the brain is particularly plastic. Whether spontaneous activity can modulate synaptic connections in adult life, remains unknown. We addressed this topic in the olfactory system and we studied whether manipulation of afferent spontaneous activity in adulthood could affect the already established and refined synaptic contacts, i.e. the intrabulbar connections. Taking advantage of the inducible nature of the Kir 2.1 construct, we allow the expression of the Kir 2.1 channels only in adulthood (P30-P60), for 30 days. We found that the expression of the Kir 2.1 channel in adults was able to induce a regression of the intrabulbar link to an unrefined and enlarged status.

Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale dei mammiferi si basa sulla specificità delle connessioni sinaptiche. Lo sviluppo di un circuito neurale è regolato sia da molecole specifiche, dette axon guidance molecules che da precisi schemi di attività elettrica che si stabiliscono tra i neuroni pre e post-sinaptici. In questo lavoro afferente spontanea nell' organizzazione topografica del bulbo olfattivo. Per raggiungere tale obiettivo abbiamo analizzato la connessione intrabulbare tra glomeruli isofunzionali (o omologhi) in una linea di topi geneticamente modificati, nei quali l' attività afferente spontanea è estremamente ridotta a causa dell'over-espressione di un canale potassio inward rectifier (Kir2.1) nei neuroni sensoriali olfattivi (Yu et al., 2004). Poichè studi precedenti avevano analizzato la connessione intrabulbare solo in animali adulti (Belluscio et al. 2002; Lodovichi et al., 2003), abbiamo dapprima studiato lo sviluppo della connessione intrabulbare tra glomeruli omologhi, a diversi stadi di sviluppo (P7-P70), in animali di controllo. Effettuando iniezioni di un tracciante fluorescente nello strato dei glomeruli, abbiamo trovato che la connessione intrabulbare tra glomeruli omologhi è presente già a una settimana di vita post-natale (P7). Tuttavia a questo stadio di sviluppo, la connessione non è circoscritta esclusivamente al glomerulo omologo corrispondente, ma più ampia. In questa fase il rapporto tra il diametro dell' iniezione e l' estensione della proiezione è 4:1. Abbiamo trovato che la connessione va incontro ad un processo di maturazione tra P15 e P30. In questo periodo si osserva un restringimento dell' estensione della proiezione che assume le dimensioni circoscritte al singolo glomerulo omologo, tale per cui il rapporto tra l' estensione della proiezione ed il diametro dell' iniezione è 1:1, proprio della connessione matura. Le dimensioni della connessione si mantengono stabili a tutti gli stadi esaminati, sino a P70. Abbiamo quindi analizzato il ruolo dell'attività afferente spontanea nella formazione e nel mantenimento della connessione intrabulbare, in animali con ridotta attività afferente spontanea, i topi Kir 2.1. Abbiamo visto che le connessioni intrabulbari sono ancora presenti in questi animali, sebbene non siano esclusivamente circoscritte ai glomeruli omologhi. Il rapporto tra l' estensione della proiezione ed il diametro dell' iniezione non raggiunge mai il valore di 1:1 , proprio della connessione matura, a nessuna delle età analizzate (P30-P70) in animali con ridotta attività afferente. In questi animali il processo di maturazione non sembra mai completarsi. Ci siamo poi chiesti quali fossero le ripercussioni di un' alterata circuiteria neurale nel bulbo olfattivo sul comportamento olfattivo. A tale scopo abbiamo utilizzato un test comportamentale classico elaborato per valutare la capacità di un animale di discriminare tra due differenti odori. Abbiamo osservato che gli animali con ridotta attività afferente non riuscivano a discriminare gli odori che attivano pattern spaziali di glomeruli (mappe funzionali) simili, quali gli enantiomeri, mentre mantenevano la capacità di discriminare odori in grado di attivare pattern spaziali di glomeruli molto distinti. Molti studi sulla formazione dei circuiti neurali nei sistemi sensoriali hanno dimostrato che l' attività spontanea gioca un ruolo chiave nella formazione dei circuiti in stadi molto precoci dello sviluppo. Una volta che i sistemi sensoriali diventano sensibili agli stimoli sensoriali specifici, l' attività elettrica evocata rafforza e completa la maturazione dei già stabiliti contatti sinaptici. E' stato chiaramente dimostrato che l' attività sensoriale modula lo sviluppo della circuiteria neurale all' interno di un periodo circoscritto (periodo critico), in cui il sistema nervoso centrale è estremamente plastico. Se l' attività spontanea abbia un ruolo sui circuiti neurali in età adulta rimaneva oscuro. Dato l' alto grado di plasticità del sistema olfattivo ci siamo chiesti se la manipolazione dell' attività elettrica spontanea in età adulta potesse modificare architetture neurali già consolidate, come ad esempio le connessioni intrabulbari. Sfruttando la natura inducibile del costrutto Kir 2.1, abbiamo permesso l' espressione del canale Kir 2.1 solamente in età adulta (P30-P60), per 30 giorni. Abbiamo scoperto che l' assenza di attività spontanea solo in età adulta è in grado di indurre la regressione della connessione intrabulbare ad uno stadio immaturo (la connessione risulta per tanto più¹ larga). Tutti assieme questi dati indicano che l'attività afferente spontanea gioca un ruolo critico non solo nella formazione dei circuiti nervosi del bulbo olfattivo, ma anche nel loro corretto mantenimento. Inoltre la modificata architettura della circuiteria bulbare si riflette in un comportamento olfattivo alterato.