Effects of familial Alzheimer's disease-linked presenilin 2 mutants on Ca2+ homeostasis of Golgi Apparatus sub-compartments

Alzheimer's Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of senile dementia. The characteristic histopathological hallmarks of AD are the intracellular neurofibrillary tangles and the amyloid plaques, made of aggregated amyloid peptides (Aß), that deposit in the extracellular matrix of the brain. Aß peptides are the result of two sequential cleavages of the amyloid precursor protein (APP); Aß is eventually released by the α-secretase enzyme. The most abundant Aß peptide species, both physiologically produced throughout life, are Aß40 and Aß42, which is more insoluble and aggregation-prone. Although most AD cases are sporadic, a small percentage of patients is affected by the hereditary form of AD (Familial Alzheimer's Disease, FAD), caused by dominant mutations in one of three genes. These genes code for the APP, presenilin-1 (PS1) and presenilin-2 (PS2); PSs are the catalytic subunits of the α-secretase enzyme complex but they also function in a α-secretase indipendent manner. FAD-linked mutations in PSs lead to an increased Aß42/Aß40 ratio, that promotes Aß plaques deposition. Beside this effect on Aß production, many mutations in PS1 and PS2 have been extensively demonstrated to cause alterations in the intracellular Ca2+ homeostasis, thus making neurons more sensitive to excitotoxic stimuli and apoptosis. The Golgi apparatus (GA) represents, together with the endoplasmic reticulum (ER), the major IP3-sensitive, rapidly mobilizable, intracellular Ca2+ store and its functionality is thus important for shaping cytosolic Ca2+ responses. Increasing evidence suggests that the GA is an heterogeneous Ca2+ handling organelle, equipped with a diverse molecular Ca2+ toolkit compared to the one expressed in the ER. For example, as Ca2+ uptake mechanisms, the GA expresses the classical sarco-endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) but also an additional Ca2+ pump, the secretory pathway Ca2+ ATPase1, SPCA1. The use of a specific Cameleon Ca2+ sensor targeted to the trans-Golgi, allowed us to directly demonstrate the functional GA heterogeneity by showing the distinct behavior of this sub-compartment: it takes up Ca2+ almost exclusively via SPCA1 (and not by SERCA); it does not release Ca2+ in response to IP3 generation, but rather accumulates the cation as a consequence of the cytoplasmic Ca2+ rise. As regard to the other GA compartments, we generated a new FRET-based Ca2+ indicator fused to the cis/medial-Golgi targeting sequence of the enzyme 1,6 N-acetylglucosaminyltransferase (C2gnT). The new probe very nicely co-localizes with the cis/medial-Golgi marker Giantin and thus was used to study Ca2+ dynamics in this compartment at single cell level. The data collected suggest that the GA is unique in terms of Ca2+ homeostasis, with compartments that are separated by a few microns, and in very rapid equilibrium with each other, that still maintain quite substantial differences in terms of ion concentration and response to external stimuli. The differences between the two GA sub-compartments, the medial and the trans-one, are confirmed by the specific effect on Ca2+ homeostasis of the expression of the FAD-linked PS2 T122R mutation. Cells expressing the mutated form of the protein show a decreased Ca2+ content in the cis/medial-Golgi but no effects on trans-Golgi Ca2+ homeostasis. PS2-T122R seems to inhibiting Ca2+ uptake in the cis/medial-Golgi by inhibiting SERCA pump activity while does not affect Ca2+ uptake, mediated by SPCA1, in the trans-Golgi. As a major Ca2+ store, the GA could play an important role in AD and understanding the contribution of GA Ca2+ dysfunction in AD will significantly impact our ability to develop more effective therapies for the disease.

La malattia di Alzheimer's (AD) è un disordine neurodegenerativo e la forma più comune di demenza senile. La caratteristica istopatologica di AD è la presenza di depositi neurofibrillari intracellulari e di placche amiloidi, costituite da aggregati di peptide amiloide (Aß), che si depositano nella matrice extracellulare del cervello. I peptidi Aß sono il risultato di due tagli sequenziali della Proteina Precursore dell'Amiloide (APP); Aß viene poi rilasciato dall'enzima α-secretasi. Le più abbondanti specie peptidiche di Aß, prodotte anche fisiologicamente per tutta la vita, sono Aß40 e Aß42, quest'ultimo più insolubile e più incline all'aggregazione. Sebbene la maggior parte dei casi di AD siano sporadici, una piccola percentuale di pazienti è affetta dalla forma ereditaria di Alzheimer (malattia familiare di Alzheimer, FAD), causata da mutazioni dominanti in uno dei geni codificanti per APP, presenilina-1 (PS1) e presenilina-2 (PS2); le PSs sono le subunità catalitiche del complesso enzimatico della α-secretasi ma funzionano anche in maniera indipendente da tale attività enzimatica. Le mutazioni in PSs legate a FAD portano ad un aumento nel rapporto Aß42/Aß40, che promuove la deposizione di placche amiloidi. Oltre a questo effetto, è stato ampiamente dimostrato che molte mutazioni in PS1 e PS2 provocano alterazioni della omeostasi del Ca2+ intracellulare, rendendo così i neuroni più sensibili agli stimoli eccitotossici e apoptotici. L'apparato di Golgi (GA) rappresenta, insieme al reticolo endoplasmatico (ER), il principale deposito intracellulare di Ca2+, IP3 sensibile, e la sua funzionalità è fondamentale per il controllo delle risposte citosoliche di Ca2+. Sempre maggiori evidenze suggeriscono che il GA sia un organello eterogeneo in termini di Ca2+ handling, essendo dotato di un diverso toolkit molecolare per il Ca2+ rispetto a quello espresso nell' ER. Ad esempio, come meccanismi di uptake per il Ca2+, il GA esprime la classica pompa SERCA (Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase) ma anche un ulteriore pompa, detta SPCA1 (Secretory Pathway Ca2+ ATPase1). L'utilizzo di uno specifico sensore per il Ca2+ specificatamente indirizzato al trans-Golgi, ci ha precedentemente permesso di dimostrare direttamente la eterogeneità funzionale del GA, mostrando il comportamento distinto di questo sub-compartimento: i meccanismi di uptake di Ca2+ sono mediati esclusivamente dalla SPCA1 (e non dalla SERCA); non rilascia Ca2+ in risposta alla generazione IP3, ma piuttosto si accumula il catione come conseguenza dell'aumento di Ca2+ citoplasmatico. Per quanto riguarda gli altri sub-compartimenti del GA, abbiamo generato un nuovo indicatore per il Ca2+ fuso alla sequenza di indirizzamento dell'enzima 1,6 N-acetylglucosaminyltransferasi (C2gnT) residente del cis/medial-Golgi. La nuova sonda co-localizza con il marcatore di cis/medial-Golgi Giantina e quindi è stata utilizzata per studiare le dinamiche di Ca2+ in questo sub-compartimento a livello di singola cellula. Complessivamente i dati ottenuti suggeriscono che il GA sia unico in termini di omeostasi del Ca2+, con tali sub-compartimenti separati da pochi micron, e in equilibrio molto rapido tra loro, ma comunque in grado di mantenere differenze consistenti in termini di concentrazione dello ione e risposta a stimoli esterni . Le differenze tra i due sub-compartimenti del GA sono confermate dall'effetto specifico sulla omeostasi del Ca2+ dell'espressione della forma mutata di PS2T122R legata alla malattia familiare di Alzheimer. Le cellule che esprimono tale proteina mostrano una diminuzione del contenuto di Ca2+ nel cis/medial-Golgi ma nessun effetto sull'omeostasi del Ca2+ nel trans-Golgi. PS2T122R sembra inibire l'assorbimento di Ca2+ nel cis/medial-Golgi, inibendo l'attività della pompa SERCA, mentre non influenza l'assorbimento di Ca2+, mediato dalla SPCA1, nel trans-Golgi. Il GA sembra quindi giocare un ruolo importante nella patogenesi di AD e comprendere il contributo di tale organello nella patogenesi di AD e la sua base fisiopatologica potrà avere un forte impatto sulla possibilità di sviluppare terapie più efficaci per AD.