Investigating The Role Of the Cellular Prion Protein in Ca2+ Metabolism And Alzheimer's Disease

The cellular prion protein (PrPC) is a highly conserved cell-surface glycoprotein expressed in almost all mammalian tissues, in particular in the central nervous systems. The bad reputation acquired by PrPC originates from its capacity to convert into an aberrant conformer (PrPSc), which is the major component of the prion, the unconventional infectious particle causing fatal neurodegenerative disorders, known as prion diseases. Both the mechanism of prion related neurodegeneration and the physiologic role of PrPC are still unknown. However, use of animal and cell models has underscored a number of putative functions for PrPC, suggesting that it could serve in cell adhesion, migration, proliferation and differentiation, possibly by interacting with extracellular partners, and/or by taking part in multi-component signaling complexes at the cell surface. An intriguing hypothesis, based on increasing amounts of data that may explain the multifaceted behavior of PrPC, entails that the protein is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis One major part of the present thesis deals with a close investigation of the alleged regulation of Ca2 homeostasis by PrPC. This study was carried out by monitoring local Ca2+ movements in primary cultures of cerebellar granule neurons (CGN) - obtained from PrP-knockout mice and transgenic PrPC-expressing mice - subjected to various stimuli. Measurements of Ca2+ fluxes in different cell domains were accomplished using the Ca2+- sensitive photo-protein aequorin genetically targeted to different cell domains (plasma membrane, cytosol, lumen of the endoplasmic reticulum and mitochondrial matrix). We found that, with respect to PrPC-expressing neurons, the absence of PrPC caused alterations of local Ca2+ movements, indicating that PrPC may be part of the cellular system(s) deputed to avoid toxic neuronal Ca2+ accumulation. As for the molecular mechanisms by which PrPC controls Ca2+ homeostasis, we found that this could be accomplished through the modulation of p59Fyn- and p42/p44-ERK-dependent signaling pathways. Another topic studied in this thesis stemmed from recent reports indicating that PrPC could acts as a high-affinity receptor for amyloid-beta (Abeta) peptides implicated in Alzheimer's disease. The possibility that PrPC-Abeta interactions may impair synaptic plasticity is, however, still highly debated. Thus, given that Ca2+ is intimately related to synaptic plasticity, we investigated whether Abeta peptides affected Ca2+ metabolism in a PrPC-dependent manner using the above-mentioned strategies and cell paradigms. The obtained results showed that interactions between PrPC and Abeta oligomers may cause Ca2+ accumulation following activation of store-operated Ca2+ entry, and that this may occur via a PrPC-dependent activation of p59Fyn kinase.

La proteina prionica cellulare (PrPC) è una glicoproteina di membrana altamente conservata nei mammiferi ed espressa abbondantemente nel sistema nervoso centrale. La cattiva reputazione attribuita a questa proteina nasce dalla sua capacità di convertirsi in un'isoforma conformazionale patologica (PrPSc), che è la componente principale del prione. Il prione è l'agente eziologico di malattie neurodegenerative fatali per l'uomo e per gli altri animali conosciute come malattie prioniche (Prusiner, 1998). Tuttavia rimangono ancora da capire sia il meccanismo attraverso cui PrPSc causa neurodegenerazione, sia la funzione fisiologica di PrPC. L'uso di svariati modelli animali e cellulari ha attribuito numerose funzioni a PrPC, suggerendo che essa sia coinvolta in numerosi processi cellulari, quali adesione, migrazione, proliferazione e differenziamento, mediante interazioni con partner extracellulari e di membrana, e/o partecipando a vie di segnalazione cellulare. Un'ipotesi plausibile che potrebbe spiegare questo comportamento poliedrico, è che PrPC sia coinvolta nella regolazione dell'omeostasi del Ca2+, il secondo messaggero che è anch'esso in grado di controllare un gran numero di processi fisio-patologici che vanno dalla sopravvivenza alla morte della cellula. Uno dei principali argomenti affrontati in questa tesi riguarda per l'appunto la possibile regolazione dell'omeostasi di Ca2+ da parte di PrPC. Lo studio è stato condotto confrontando i flussi locali di Ca2+ in colture primarie di neuroni granulari cerebellari (NGC) ottenuti da topi privi di PrPC o esprimenti la proteina, a seguito dell'applicazioni di stimoli opportuni. Per il monitoraggio del Ca2+ si è impiegata la sonda Ca2+-sensibile equorina indirizzata a specifici comparti cellulari (membrana plasmatica, citosol, lume del reticolo endoplasmico e matrice mitocondriale). Si è trovato che, rispetto ai neuroni esprimenti la PrPC, l'assenza della proteina comporta alterazioni dei flussi locali di Ca2+, così suggerendo che PrPC possa far parte dei sistemi che proteggono il neurone dall'accumulo tossico di Ca2+. Per quanto riguarda i meccanismi molecolari attraverso cui PrPC controlla l'omeostasi del Ca2+, si è scoperto che questo potrebbe essere realizzato mediante la modulazione delle vie di segnalazione dipendenti dalle chinasi p59Fyn e p42/p44-ERK. Un altro tema di studio oggetto di questa tesi si collega a dati recenti che hanno evidenziato come la PrPC possa legare con alta affinità i peptidi Abeta implicati della malattia di Alzheimer. La possibilità che queste interazioni alterino la plasticità sinaptica è, tuttavia, molto dibattuta. Pertanto, dal momento che il Ca2+ è finemente coinvolto in questo processo, si è voluto esplorare se la presenza dei peptidi Abeta influisca sui flussi di Ca2+ in maniera dipendente da PrPC. A tal scopo si sono usate sia le strategie sia i modelli cellulari sopra descritti. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l'incubazione dei neuroni con oligomeri Abeta causa l'influsso di Ca2+ nella cellula dopo attivazione della via nota come "store-operated Ca2+ entry", e che questo processo potrebbe avvenire mediante l'attivazione di p59Fyn dipendente da PrPC.