Development of microfluidic cell culture technology for the study of type 2 diabetes

Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is a multi-factorial disease due to metabolic disorder with injuries in glucose homeostasis and body’s glucose uptake. The complexity of this disease led to the use of different classes of drugs acting with different mechanisms and targets and with effects that often change between patients. The number of people in the world with diagnosed T2DM is constantly increasing and consequently the cost for healthcare. Nowadays, a defined cure for T2DM patients has been not clearly identified. In the study of diabetes, animal models are one of the most popular systems used to underline its pathogenesis and to screen new drugs before clinical trials on humans. Even though their undeniable utility, they showed many limitations. Moreover, studies in vivo in humans are possible but tremendously expensive and require a huge effort in terms of ethical approval and safety issues. Therefore in vivo studies often do not permit an evaluation at specific tissue level: their interplay complexity allow a very difficult outcome interpretation. For all these reasons there is a great interest in developing alternative in vitro models that facilitate pharmaceutical and pathology studies. Thus, the aim of this thesis is the development of an in vitro model that closely resemble the human physiology and mimic the pathophysiological conditions of type 2 diabetes. In particular, this work concerns the design and development of microfluidic technology for the study of insulin resistance and glucose uptake in cell and tissue culture from Type 2 Diabetes patients. High temporal resolution glucose uptake measurements were achieved by coupling microfluidic technologies and glucose detection measurements with a non invasive manner. The technology was applied to skeletal muscle and ex vivo adipose tissue, with the obtainment of high sensitive and reproducible experiments. During this PhD, a microfluidic platform was developed and fabricated with multilayer soft lithography techniques. The platform was able to integrate 2D (cells) and 3D (ex vivo tissue) culture allowing long term viability and metabolic activity. High experiment feasibility was achieved by the long term culture capability. Micro components were included into the device allowing automation and liquid handling control. Integrated microvalves and micropumps allowed the development of injection systems for high spatio temporal control of biochemical stimulus delivery, such as insulin and other anti-diabetic drugs. Glucose uptake was investigated measuring high temporal resolution glucose concentration in the downstream culture chamber medium by high sensitive analytical measurements on nanoliter sampling, providing glucose dynamic with temporal resolution of minutes. The measurement of intracellular glucose concentration was evaluated by encoded FRET nanosensor. The coupling between intracellular and extracellular glucose detection allowed the determination of novel glucose uptake and glycolytic rate evaluation technique within the cell. These results show a good potential in future pharmaceutical and clinical experimentation, in which the use of a microfluidic ex vivo human patient assays could be useful in drug screening studies and patient specific therapies.

Il Diabete Mellito di Tipo 2 (T2DM) è una patologia molto complessa provocata da una disfunzione a livello omeostatico che ha come conseguenza l’alterazione del normale consumo di glucosio da parte delle cellule e, conseguentemente, una elevata concentrazione di glucosio nel sangue. La complessità della malattia comporta l’utilizzo di molti farmaci che agiscono con diversi meccanismi e modi, e con effetti che spesso sono differenti tra pazienti. Il numero di persone nel mondo con T2DM diagnosticato è sempre più elevato e con esso l’impatto sul costo dell’assistenza sanitaria. Al giorno d’oggi una cura definita per questa patologia non esiste. I modelli animali sono tra i sistemi più usati nello studio della patologia e per valutare l’effetto di nuovi farmaci in fase preclinica. Anche se validi, ed essendo tuttora i più usati, questi modelli mostrano numerose limitazioni. Gli studi in vivo su uomo sono possibili ma molto costosi; richiedono inoltre un enorme contributo in termini di provvedimenti etici e di sicurezza. Molto spesso non si riesce ad ottenere una valutazione a livello di singolo tessuto con la conseguente difficoltà di una corretta interpretazione dei risultati. Per tutte queste ragioni è elevato l‘interesse nello sviluppare modelli in vitro alternativi che facilitino da un lato lo studio della patologia e dall’altro la ricerca farmacologica. Obiettivo di questa tesi è di sviluppare un modello in vitro rappresentativo della fisiologia di tessuti umani in grado di simulare la fisiopatologia del Diabete Mellito di Tipo 2. In particolare, questa tesi riporta la progettazione e lo sviluppo di una tecnologia microfluidica applicata allo studio dell’insulino-resistenza e del consumo di glucosio in colture cellulari e tessuti umani in vitro. Attraverso l’impiego di tecnologie microfluidiche, applicate a tecniche di misurazione del glucosio, è stato possibile misurare con elevata risoluzione temporale il consumo di glucosio in modo completamente non invasivo. La tecnologia è stata applicata al muscolo scheletrico e al tessuto adiposo, ottenendo elevato grado di riproducibilità degli esperimenti e sensibilità nelle misure. Durante questa tesi alcuni prototipi di piattaforma microfluidica sono stati sviluppati e prodotti attraverso tecniche di soft litografia multistrato. Il dispositivo è in grado di integrare al suo interno sia colture cellulari 2D che di tessuto 3D ex vivo, mantenendole metabolicamente attive e vitali per diversi giorni. La capacità di coltura a lungo termine ottenuta ha permesso elevata flessibilità degli esperimenti. Il dispositivo è stato dotato di microcomponenti integrati per il controllo e la movimentazione di liquidi. Microvalvole e micropompe integrate permettono un elevato grado di automazione della piattaforma, con possibilità di controllo off chip tramite software. Tali sistemi di controllo hanno permesso lo sviluppo di sistemi di iniezione per un elevato controllo spazio temporale di sostanze biochimiche, come ad esempio insulina o altri farmaci antidiabetici. Il consumo di glucosio è stato valutato attraverso misure ad alta risoluzione del medium di coltura post camera attraverso tecniche analitiche di misura su nanolitri di campioni, generando profili temporali di concentrazione di glucosio con risoluzione di decine di minuti. È stata misurata la concentrazione di glucosio intracellulare attraverso nano sensori FRET. L’accoppiamento di queste due tecniche ha permesso una valutazione innovativa del consumo di glucosio e attività cellulare. I risultati ottenuti rivelano buone potenzialità per future sperimentazioni farmaceutiche e cliniche. Lo sviluppo di tecnologie microfluidiche integrate a colture ex vivo derivate da pazienti può dare buoni risultati nello sviluppo di terapie paziente specifiche.