Dopamine and dopamine-quinones toxicity in Parkinson's disease: cellular models revealing a possible role for superoxide dismutases

Parkinson’s disease is a widespread neurodegenerative disorder that affect 2% of the population above the age of 60. The hallmark of the pathology is the preferential degeneration of the dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta of the midbrain, and the presence of proteinaceous inclusions called Lewy bodies in the surviving neurons (Braak 2004). In 10% of the cases, the disease is linked to mutation on several genes, among them α-synuclein, DJ-1, PARKIN, PINK1 and LRRK2, but in the vast majority of the cases the aetiology is still unknown (sporadic PD) (Gwinn-Hardy 2002). Post mortem studies and in vitro and in vivo PD model have revealed a possible interconnection between genetic and sporadic PD, which involves both mitochondrial dysfunction and oxidative stress as central players in the pathogenesis of the disease (Gilgun-Sherki Y. et al. 2001, Mythri R. B. et al. 2011). Oxidative stress is a condition characterized by the inability of the cellular antioxidant defences to cope with the production of reactive oxygen species (ROS). This condition of unbalance between the production and the clearance of ROS causes irreversible damage to cellular components such as lipids, proteins and DNA, leading eventually to cell death (Lotharius et al. 2002). Among the enzymes implicated in the detoxification of ROS, are superoxide dismutases (SODs) that catalyze the dismutation of superoxide anion into molecular oxygen and hydrogen peroxide (Fridovich 1995). Since oxidative stress does not explain alone the selectivity death of dopaminergic neurons, the main working hypothesis is that dopamine itself could have a central role. Under physiological conditions, dopamine is synthesized in the cytosol and stored in synaptic vesicles by the action of Vesicular Monoamine Transporter (VMAT2) where it is stabilized by the low pH (Erickson, J. D 1992). If the amount of cytosolic DA exceeds the physiological concentration, DA is metabolized to the non-toxic metabolite 3,4-dihydroxyphenylacetic acid and hydrogen peroxide by the action of monoamine oxidase (MAO) and aldehyde dehydrogenase, or sequestered into lysosomes where it can auto-oxidize to form neuromelanin (NM). If not buffered by these pathways, cytosolic DA can be oxidized to DA-quinone (DAQs) (spontaneously or enzymatically), (Sulzer, D., 2000, Elsworth, J. D. 1997), a reaction that also leads to the formation of ROS. On these premise, we evaluated two line of research using a cellular model for PD (SH SY5Y cell line): one concerning about the effect of dopamine and its oxidized forms on cellular viability, the second one on the potential role of superoxide dismutases (1 and 2) over expression. From the use of different techniques we started to evaluate which kind of cell death pathway was activated by dopamine and DAQs. Looking for the presence of nuclear fragmentation, that is one of the later stages of apoptosis, we determined that both dopamine and DAQs induce cell death via apoptosis but the dopamine toxicity depends on its internalization by the action of the dopamine transporter (DAT), since the pre-treatment of cells with GBR 12909 (a DAT inhibitor) had a rescue effect. To confirm the apoptotic pathway we also evaluated another hallmark of apoptosis (one of the former stages of the apoptotic cascade): phosphatidil-serine externalization (PS) using ANNEXIN-V-FLUOS; a specific probe for PS. Using flow cytometry we confirm that both dopamine and DAQs induce cell death via apoptosis. Next we wanted to evaluate if dopamine and DAQs exert their toxicity from extracellular environment or they are required to enter in the cells. Treating cells with GBR12909, we demonstrate that dopamine needs to enter cells to exert its toxicity (since the treatment with the DAT inhibitor rescues cells from DA toxicity) while DAQs toxicity was not affected by this treatment leading to cell death. Since oxidative stress is one of the mechanisms that have been implicated in the pathogenesis of PD, and the chemistry of dopamine (auto-oxidation and enzyme-mediated oxidation) leads to the production of ROS, we evaluate the production of mitochondrial superoxide anion using a specific probe. The data demonstrate that only the auto oxidation of dopamine leads to the production of superoxide anion and dopamine is required to enter cell to exert its effect. To dissect more in depth the toxicity mechanism of both dopamine and DAQs, and since only cytosolic dopamine led to the production of mitochondrial superoxide anion, we asked if this two different oxidation processes activated different cell death pathways (the major are the mitochondrial one and the one mediated by death receptor) or not. From preliminary data we observed a marked difference in the activation of caspase 3 and the subsequent cleavage and inactivation of Poly (ADP) ribose polymerase (PARP) due to DAQs treatment convincing us to proceed in the investigation of the possible differences between this different oxidation processes. The second part of the work was focused on the role for superoxide dismutases 1 and 2 against dopamine and DAQs cytotoxicity since previous data demonstrated a role in superoxide anion production and induction of cell death in the case of cytosolic dopamine. Over expression of both SOD1 and SOD2 revealed a protective effect against dopamine cytotoxity, while they were not able to counteract DAQs-induced cell death. In the present work the main working hypothesis was that oxidative stress induced by dopamine and its oxidized forms accumulation could have a central role in the specific dopaminergic cell loss in Parkinson’s disease. The data obtained so far seems to highlights that dopamine and DAQs activates different apoptotic pathway that are superoxide anion-dependent for DA and superoxide anion-independent for DAQs. Since oxidative stress is considered one of the mechanism that interconnect genetic form and sporadic forms of the pathology and dopamine, in its oxidative chemistry, leads to the production of ROS, understanding which cell death pathways are activated and to which extent, is crucial to develop a therapy to counteract the start and the progression of the pathology. Data from the over expression of SODs demonstrate that compounds that counteract the production of superoxide anion (like SOD-mimetics that are currently used for other diseases) could have a protective role against the oxidative stress and the subsequent cell death condition induced by dopamine. Also compounds that block the activation of the apoptotic cascade induced by dopamine and DAQs could rescue cells from dying in this neurodegenerative disease

La malattia di Parkinson è una diffusa sindrome neurodegenerativa che affligge circa il 2% della popolazione oltre l’età dei 60 anni. La caratteristica principale della patologia è la preferenziale morte dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta del mesencefalo, e la presenza di inclusioni proteinacee chiamate Lewy body nei neuroni sopravvissuti. Nel 10% dei casi, la malattia è collegata a mutazioni su diversi geni, tra i quali α-synucleina, DJ-1, PARKIN, PINK1 e LRRK2, ma nella maggior parte dei casi (Parkinson sporadico) (Gwinn-Hardy 2002) l’eziologia è ancora sconosciuta. Da studi post mortem e da modelli in vitro e in vivo per il PD è stata rilevata una possibile connessione tra le forme genetiche e quelle sporadiche che implica sia la disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo come fattori centrali nella patogenesi della malattia (Gilgun-Sherki Y. et al. 2001, Mythri R. B. et al. 2011). Lo stress ossidativo è una condizione in cui le capacità antiossidanti della cellula non sono in grado di sopperire alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Questa condizione di sbilanciamento tra la produzione e la detossificazione dei ROS causa danni irreversibili ai componenti cellulari come lipidi, proteine e DNA, portando alla morte cellulare (Lotharius et al. 2002). Tra gli enzimi coinvolti nella difesa antiossidante delle cellule, le superossido dismutasi giocano un ruolo fondamentale poiché catalizzano la dismutazione dell’anione superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno (Fridovich 1995). Poiché lo stress ossidativo non spiega da solo la selettiva morte dei neuroni dopaminerigici, l’ipotesi è che la dopamina stessa abbia un ruolo chiave. In condizioni fisiologiche, la dopamina viene metabolizzata nel citosol e stoccata all’interno delle vescicole sinaptiche grazie all’azione del trasportatore vescicolare delle monoamine 2 (VMAT2) dove è stabilizzata dal basso pH (Erickson, J. D 1992). Se la concentrazione citosolica di dopamina supera quella fisiologica, essa viene metabolizzata ad acido 3,4-diidrofenilacetico e perossido di idrogeno grazie all’azione dell’enzima monoamina ossidasi (MAO) e aldeide deidrogenasi, o sequestrata nei lisosomi dove può auto ossidarsi a formare neuromelanina. Se non è metabolizzata in questi pathway, la dopamina può essere ossidata a dopamino-chinoni (DAQs) (spontaneamente o enzimaticamente) (Sulzer, D., 2000, Elsworth, J. D. 1997), una reazione che produce anche specie reattive dell’ossigeno (ROS). Con queste premesse, abbiamo valutato due linee di ricerca usando un modello in vitro per il PD (la linea cellulare SH SY5Y): la prima riguardante l’effetto della dopamina e le sue forme di ossidazione sulla vitalità cellulare, la seconda sul potenziale ruolo dell’over espressione delle superossido dismutasi (1 e 2). Utilizzando differenti tecniche abbiamo iniziato a valutare quale pathway di morte cellulare veniva attivato dalla dopamina e dalle sue forme ossidate. Andando a valutare la frammentazione nucleare, uno degli ultimi stadi dell’apoptosi, abbiamo determinato che sia la dopamina sia i chinoni inducono l’attivazione di questo processo di morte. Per confermare il processo apoptotico, abbiamo valutato un altro marker: l’esternalizzazione delle fosfatidil-serine (PS): uno dei primi stadi di attivazione del processo apoptotico. con l’utilizzo di ANNEXIN-V-FLUOS, una sonda specifica per le PS. Mediante la tecnica di citoflurimetria abbiamo confermato che sia la dopamina che i chinoni attivano l’apoptosi. Successivamente abbiamo voluto valutare se la dopamina e i chinoni avevano effetti tossici a livello extracellulare o necessitavano di entrare nelle cellule. Pre-trattando le cellule con l’inibitore specifico del trasportatore della dopamina (GBR 12909) abbiamo dimostrato che la tossicità della dopamina è dipendente dal suo trasporto all’interno della cellula (in quanto il trattamento con l’inibitore ha avuto un effetto protettivo per le cellule), mentre i chinoni non lo necessitano. Poichè lo stress ossidativo è stato proposto come possibile meccanismo implicato nella patogenesi della malattia, e la chimica ossidativa della dopamina (auto ossidazione e ossidazione mediata da enzimi) porta alla produzione di specie radicaliche, abbiamo valutato la produzione dell’anione superossido (la prima specie radicalica prodotta soprattutto a livello del mitocondrio) usando una sonda specifica. I dati dimostrano che solo il processo auto ossidativo della dopamina porta alla produzione di anione superossido e che questo processo è dipendente dall’internalizzazione della dopamina a livello del trasportatore. Per comprendere maggiormente il meccanismo alla base della tossicità del processo di ossidazione e ossidazione mediate da enzima della dopamina abbiamo valutato altri marker di apoptosi. Poiché dai dati precedenti è stato visto che solo la dopamina citosolica era in grado di indurre la produzione dell’anione superossido a livello del mitocondrio, abbiamo voluto verificare se i due processi ossidativi della dopamina, attivassero differenti pathway apoptotici (i prevalenti comprendo la via mediata dai recettori di morte, l’altro quella mitocondriale). Dati preliminari dimostrano una marcata attivazione della caspasi 3 e la conseguente inattivazione della poli (ADP) ribosio polimerasi in conseguenza al trattamento con i chinoni suggerendoci di investigare maggiormente sulle possibili differenze tra i diversi processi ossidativi della dopamina. La seconda parte del progetto si è focalizzata sul possibile ruolo delle superossido dismutasi 1 e 2 contro la tossicità indotta dalla dopamina e dai suoi prodotti di ossidazione. L’over espressione sia della SOD1 che della SOD2 hanno rivelato un effetto protettivo contro la produzione di anione superossido indotto dalla dopamina, mentre non hanno presentato alcun effetto contro la tossicità indotta dai chinoni rimarcando il ruolo dell’anione superossido nella tossicità indotta dalla dopamina. Nel presente progetto di dottorato, abbiamo valutato l’ipotesi che lo stress ossidativo indotto dalla dopamina e dalle sue specie ossidate possa avere un ruolo chiave nella specifica degenerazione dei neuroni dopaminergici caratteristici della malattia di Parkinson. I dati ottenuti sembrano dare indicazioni sulla differente attivazione di pathway di morte cellulare indotta dalla dopamina e dalle sue forme ossidate con un differente ruolo nella produzione dell’anione superossido. Poichè lo stress ossidativo è considerate uno dei meccanismi che collegano il Parkinson sporadico a quello genetico e la dopamina, nella sua chimica ossidativa, porta alla produzione di specie radicaliche, riuscire a capire quale pathway di morte cellulare è attivato e in quale misura, è cruciale per lo sviluppo di terapie per impedire l’inizio e la progressione della malattia. I dati derivanti dall’over espressione delle superossido dismutasi dimostrano che composti che impediscono la formazione dell’anione superossido (come SOD-mimetici che sono attualmente usati per altre patologie) potrebbero avere un ruolo protettivo contro lo stress ossidativo e la conseguente morte cellulare indotta. Inoltre, anche composti in grado ci bloccare la cascata apoptotica indotta da dopamina e chinoni potrebbe proteggere dalla morte le cellule affette in questa malattia neurodegenerativa