Development of polymeric drug delivery systems for biotech products

Since the early 80’s the forward steps in genetics and proteomics, have led a particular interest to biotech products, such as DNA and proteins. Although difficult, their large-scale production enabled the therapeutic use of this compounds. Proteins and DNA sequences can be very interesting therapeutic molecules owing to their high selectivity/affinity for the receptor or the specific site of action. Unfortunately, some issues still limit their pharmaceutical use, such as the susceptibility to enzymatic degradation, rapid renal clearance and immunogenicity. To overcome these limitations, many researchers are seeking solutions in the field of drug delivery systems (DDSs). In this respect, many systems have been developed and conjugation with PEG (polyethylene glycol) can be considered one of the leading approaches. PEGylation brings to the conjugated molecule great solubility and stability to proteolytic digestion, furthermore it reduces the tendency to aggregate and reduces the immunogenicity. Thanks to these advantages and the particular characteristics of PEG, to date, there are on the market 12 pegylated compounds: 9 are proteins, one peptide, one aptamer and a liposomal formulation, containing doxorubicin. The improvements in the pharmacokinetic profile of these drugs, thanks to the use of drug delivery systems, can be also applied in the field of tissue engineering, where the same issues are of fundamental importance for the development of scaffolds for cells capable of releasing growth factors. In the last years various polymers have been studied by many research groups to find an alternative to PEG, but its excellent biocompatibility and the know-how in its use has not brought any polymer to be truly competitive against PEG. Nevertheless, PEG presents some limits such as its non-biodegradability and in some case there are reports of antibodies against PEG. Therefore, there is an increased need for a PEG substitute. In the first section of this work hyaluronic acid (HA) has been studied as a candidate polymer for bioconjugation of proteins (HAylation). HA, being biodegradable can compensate this limit of PEG. HA, is also present in humans and is metabolized by hyaluronidase. Moreover, HA has the advantage of a high loading compared to PEG, thanks to the presence of repetitive functional groups in each monomer. This part of the work was focused on the study of HA conjugation (HAylation) to two model enzymes, trypsin and Ribonuclease A, and then to an interesting protein in pharmaceutical field, insulin. In order to avoid cross-linking phenomena, only a fraction of all carboxyl groups of the polymer has been modified to aldehyde allowing the conjugation with the amino groups of the protein models. Furthermore, by modulating the pH of reaction two protein-HA conjugates were obtained, selective N-terminal (pH 6) or random (pH 8), this taking advantage of the different pKa values of the amino groups in the proteins. The first products obtained with the enzymes Ribonuclease A and trypsin were tested verifying the residual activity compared to the native proteins. All conjugates, in particular those obtained by N-terminal selective conjugation, maintain a good activity on small substrates (30% decrease); only the HA-derived trypsin retains about 60% of residual activity against the substrate with a high weight molecular. Furthermore, enhanced stability over time was found for HA-trypsin respect to the free enzyme (45% on average) and also susceptibility to hyaluronidase was confirmed for both conjugates. Polymer validation as potential protein carrier was then evaluated by preparing conjugates with bovine insulin, as an example of pharmacologically active protein. Two conjugates were synthesized by N-terminal selective conjugation starting from polymers with different degree of aldehyde derivatization, 4% and 21%, yielding products with a protein loading of 17% and 32% (w/w), respectively. The therapeutic efficacy of the conjugates in comparison with insulin was tested in Sprague Dawley rats with induced diabetes. The conjugate with a lower protein loading was more effective and with a longer pharmacodynamic effect on the reduction on blood glucose level. The second section of the work was focused on an innovative strategy of enzymatic PEGylation of oligonucleotides. Briefly, the method investigated on model oligonucleotides is composed of two steps: the first consists in the chemical conjugation of a short oligonucleotide to a PEG chain, the second step is the enzymatic-mediated conjuagation of the PEGylated oligonucleotide with a DNA sequence by the DNA T4 ligase. To study the enzymatic PEGylation, 4 oligo sequences have been prepared as ligation model: two complementary pairs ending with sticky-ends in turn complementary (18-mer + 21-mer and 16-mer + 19-mer). The 18-mer has a thiol group in 5’-ending, in order to perform the coupling with PEG. Applying some modifications to ligation classical protocols, excellent results were obtained: PEGylated portion completely ligate the other ds-DNA and no undesired products were found. To further confirm the effective ligation, the ligated and PEGylated sequence was restricted with EcoRI. Indeed, the EcoRI recognized a sequence that is present only the ligated DNA. Complete restriction was found in absence and even in the presence of the polymer, further confirming the successes of ligation. Furthermore it was investigated if a reduced number of bases coupled to PEG can still preserve the requirements for the ligase enzyme activity. Thus, the pair of the complementary sequences then coupled to PEG has been reduced to half (9-mer + 12-mer). Even with a shorter PEGylated sequence a complete ligation was obtained. In conclusion in this thesis it has been demonstrated that HA can be a valid alternative to PEG for protein conjugation. In the field of oligonucleotide delivery an enzymatic approach of oligonucleotide conjugation can open new horizons that so far have not been completely explored.

Dai primi anni 80 i passi avanti fatti nel campo della genetica e della proteomica, hanno portato ad un particolare interesse nei confronti dei prodotti biotecnologici, quali DNA e proteine. L’utilizzo terapeutico di queste entità, seppur non privo di difficoltà, è stato facilitato dalla loro produzione su larga scala. Proteine e sequenze oligonucleotidiche si sono rivelate interessanti come agenti terapeutici essendo molecole dotate d’elevatissima selettività/affinità per il recettore o il sito d’azione specifico. L’impiego farmaceutico può evidenziare alcuni svantaggi che ne possono limitare l’utilizzo, come ad esempio la suscettibilità alla degradazione da parte di proteasi e DNasi, la rapida clearance renale e l’immunogenicità. Per affrontare tali limiti, molti ricercatori hanno cercano soluzioni nel campo dei drug delivery sistems (DDSs). A tal proposito, sono stati sviluppati molti sistemi e la coniugazione al PEG (polietilen glicole) è risultata essere una delle più promettenti. La PEGhilazione, infatti, conferisce alle molecole coniugate maggiore solubilità e stabilità nei confronti della digestione proteolitica, una ridotta tendenza all’aggregazione ed una ridotta immunogenicità. Grazie a questi vantaggi ed alle particolari caratteristiche del PEG, ad oggi sono presenti nel mercato 12 composti PEGhilati: 9 sono proteine, un peptide, un aptamero ed una formulazione liposomiale (contenente doxorubicina). Le migliorie apportate ai profili farmacocinetici di questi farmaci biotech grazie all’uso di DDSs possono essere anche impiegate nel campo dell’ingegneria tessutale, dove le medesime problematiche sono di basilare importanza per lo sviluppo di scaffold per cellule, in grado di rilasciare fattori di crescita. Il polietilen glicole (PEG) è il polimero leader per la coniugazione di proteine. Negli ultimi anni diversi polimeri sono stati studiati per trovare una valida alternativa a questo polimero, ma la sua eccellente biocompatibilità e la conoscenza nel suo utilizzo non ha ancora portato nessun polimero ad essere realmente competitivo nei suoi confronti. Nonostante tutto, anche l’utilizzo del PEG presenta alcuni limiti, quali la non-biodegradabilità e la documentata presenza di anticorpi anti-PEG sviluppati in alcuni casi specifici. Per questo motivo si è alla ricerca di un polimero che possa validamente sostituire il PEG. Nella prima parte di questo lavoro di tesi è stato studiato l’acido ialuronico (HA) per la bioconiugazione di proteine (HAylation). Essendo biodegradabile, l’HA può essere vantaggioso rispetto al PEG. L’HA è un polimero endogeno ed è metabolizzato dalle ialuronidasi, inoltre ha il vantaggio di poter raggiungere una capacità di loading elevate rispetto al PEG, grazie alla presenza di gruppi funzionali ripetitivi in ciascun monomero. In questa parte del lavoro di tesi, la ricerca si è concentrata sullo studio della coniugazione dell’HA a due enzimi modello, Ribonuclease A e tripsina, e poi ad un interessante proteina per uso farmaceutico, l’insulina. Per evitare fenomeni di cross-linking, solo una parte dei gruppi carbossilici del polimero è stata coniugata ad uno spacer aldeidico, consentendo la coniugazione con i gruppi amminici delle proteine. Inoltre, modulando il pH di reazione si sono potuti ottenere coniugati con legame selettivo all’N-terminale (pH 6) oppure random (pH 8), sfruttando la differente pKa degli ammino gruppi nelle proteine. I primi coniugati ottenuti con gli enzimi Ribonuclease A e tripsina sono stati studiati verificandone l’attività residua rispetto alle proteine native. Tutti i coniugati, in particolare quelli ottenuti per legame selettivo all’N-terminale, mantengono una buona attività su piccoli substrati (diminuzione del 30%); solo il derivato HA-tripsina mantiene circa il 60% di attività residua nei confronti del substrato ad alto peso molecolare. Inoltre, sempre per HA-tripsina, si è trovata una maggiore stabilità nel tempo rispetto l’enzima nativo (mediamente 45%) e si è confermata la suscettibilità di entrambe i coniugati nei confronti della ialuronidasi. La valutazione del polimero come potenziale carrier per proteine è proseguita preparando dei coniugati con l’insulina bovina, come esempio di proteina farmacologicamente attiva. Sono stati sintetizzati due coniugati con modalità selettiva all’N-terminale a partire da polimeri con diverso grado di modifica con gruppi aldeidici, pari a 4 e 21% e si sono ottenuti prodotti con il 17 e 32% (p/p), rispettivamente, di loading proteico. L’efficacia terapeutica dei coniugati in comparazione con l’insulina è stata testata su ratti Sprague Dawley con diabete indotto. Il coniugato con un minore loading proteico si è rivelato essere più efficace e con una riduzione dei livelli di glucosio nel sangue più prolungata. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi si è studiata un’innovativa strategia di PEGhilazione enzimatica di sequenze oligonucleotidiche al fine di sviluppare questo approccio per il delivery di oligonucleotidi. Il metodo è stato messo a punto con sequenze nucleotidiche modello e l’approccio è stato il seguente: una breve sequenza oligonucleotica viene legata chimicamente ad una catena di PEG. Poi, mediante l’azione catalitica della T4 DNA ligase la porzione di PEG-DNA viene coniugata ad un’altra sequenza oligonucleotidica. Per lo studio di PEGhilazione enzimatica si è ideato un modello costituito da 4 sequenze oligonucleotidiche di riferimento: due coppie complementari terminanti con sticky-ends complementari a loro volta (18-mer + 21-mer e 16-mer + 19-mer). L’oligo di 18 nucleotidi portava in posizione 5’ una funzione tiolica, che è stata impiegata per la coniugazione col polimero. Dopo aver apportato alcune variazioni ai protocolli classici di ligazione si sono ottenuti ottimi risultati: completa ligazione del modello PEGhilato ed assenza di prodotti indesiderati. Un’ulteriore conferma di ligazione del modello PEGhilato si è ottenuta tramite digestione con EcoRI. Infatti, solamente dopo la ligazione è possibile trovare nella sequenza oligonucleotidica il sito di restrizione dell’enzima. In presenza o in assenza di polimero la restrizione è avvenuta completamente. Si è poi voluto indagare se una sequenza PEGhilata con un numero di basi ridotto potesse comunque mantenere i requisiti per essere substrato della T4 DNA ligase. Così, la coppia di sequenze complementari designata alla PEGhilazione è stata ridotta alla meta della sua lunghezza (9-mer + 12-mer). Anche con la sequenza PEGhilata così accorciata la ligazione è avvenuta completamente. In conclusione questo lavoro di tesi ha dimostrato che l’HA può essere una promettente alternativa al più noto PEG per la modifica di proteine. Nell’ambito del delivery di oligonucleotidi lo sviluppo di un approccio enzimatico di coniugazione può aprire nuovi orizzonti in questo settore il cui potenziale non è stato ancora esplorato.