The role of specific serum/plasma proteins in the modulation of the cellular response to amorphous silica nanoparticles

Nanoparticles are structures of different dimensions (1-100 nm) and composition (metal oxides, organic acid polymers, silica polymers) present in the environment as a consequence of natural processes (such as volcanic eruptions or dusts erosion) or anthropogenic activities (industrialization or pollution). In the last decades they have been intensely studied and engineered for industrial applications (as additive of food, cosmetics and building materials) and medical purposes, where they can be employed as drug carriers or imaging agents. Thanks to its abundance, cheapness and resistance to a variety of environmental perturbations, silicon dioxide (SiO2) is one of the most widely used materials in both industrial and biomedical fields in its amorphous form (contrary to crystalline silica that causes silicosis, a chronic pulmonary disease common in occupational categories largely exposed to silica crystals, such a miners and ceramic workers). Despite amorphous silica is considered much less dangerous than crystalline silica, recent evidences have shown cytotoxic and pro-inflammatory potential in in vitro and animal models. To shed more light on this topic, in the first part of my PhD work I have characterized amorphous silica toxicity and inflammatory effects in primary human monocytes and macrophages (myeloid professional phagocytic cells) and on primary human lymphocytes and HeLa cells (lymphoid and epithelial non-phagocytic cells), using as nanoparticles model the commercial non labeled Ludox TM40 (29 nm Ø) and the fluorescein labeled Stöber (35 nm Ø). In particular, the influence of serum and the possible mechanisms determining silica nanoparticles (SiO2-NPs) effects have been investigated. I have found that SiO2-NPs toxicity (evaluated as mitochondrial dysfunction and plasma membrane permeabilization) was stronger in phagocytes (LD50 after 18 h exposure 40 µg/ml) and, in these cells, associated to the production of the three main inflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF- alpha and IL-6). On the contrary, non phagocytic cells were much more resistant (LD50 after 18 h exposure 300-500 µg/ml) and, curiously, HeLa cells were subjected apoptosis after SiO2-NPs treatment (while monocytes, macrophages and lymphocytes became necrotic). Cytofluorimetric and confocal microscopy analysis have shown that SiO2-NPs were engulfed in acidic compartments (phagolysosomes) in monocytes and macrophages, while they mostly localized onto plasma membrane in HeLa cells. This suggested that the higher sensitivity of the two phagocytic models could be due to the more efficient internalization of the particles, followed by lysosomal rupture (as indicated by experiments showing the decrease of the fluorescence associated to the lysosomotropic agent Lysotracker upon cellular exposure to high NPs doses) and the consequent liberation of lysosomal proteases (as reported in literature for crystalline silica). To investigate if acidic lysosomal pH could influence SiO2-NPs cytotoxicity in phagocytes, cells were treated with silica in the absence or in the presence of two pH neutralizing agents (NH4Cl and Bafilomycin AI), resulting in a significant protective effect in monocytes and in a negligible protection in macrophages. As mentioned above, we found that in myeloid cells SiO2-NPs induced an inflammatory response (more pronounced in monocytes), starting in the correspondence of the beginning of cytotoxicity, reaching a peak and decreasing at high NPs doses because of the strong and anticipated cellular death. In particular, IL-1b was the cytokine most represented in both cellular types, while TNF-alpha and IL-6 levels were lowers. Moreover, in monocytes (and, in less degree in macrophages) IL-1beta production was synergized by the co-stimulation with silica and lypopolisaccharide (LPS). Since crystalline silica is known to activate the NLRP3 inflammasome (a cytosolic multiprotein complex responsible of the production of some inflammatory cytokines, primarily IL-1beta) we investigated NLRP3 activation by amorphous SiO2-NPs in our myeloid cellular models. We found that monocytes and macrophages treatment with SiO2-NPs increased pro-IL1beta levels, and that its conversion into mature IL-1beta involved caspase 1 activation, intracellular ATP release and subsequent binding to ATP receptor P2X7. Interestingly, P2X7 blockage did not affect SiO2-NPs induced cellular death in both cells, and caspase 1 inhibition did not reduce SiO2-NPs toxicity in macrophages but showed a protective effect in monocytes, suggesting that amorphous silica might induce pyroptosis (a caspase 1 dependent cellular death) in these cells. Afterwards, I have studied how serum could modulate SiO2-NPs toxicity and pro inflammatory effects. In the presence of increasing FCS amount both SiO2-NPs cytotoxicity threshold and LD50 were shifted to higher NPs doses, indicating a serum protective action (more pronounced in non-phagocytic cells in comparison to phagocytes). In parallel, also inflammatory cytokines production in myeloid cells occurred at higher NPs concentrations with the increment of FCS percentage. To investigate if the protective serum effect reflected a modification in NPs cellular association I have performed experiments with the fluorescent Stöber NPs, finding that the presence of serum strongly decreased NPs cellular binding in lymphocytes and HeLa, with a moderate reduction in monocytes and macrophages. This result was in accord with the stronger serum protection in non phagocytic cells, and consolidated the hypothesis that SiO2-NPs toxicity depends on their interaction level with cells. Also SiO2-NPs cellular localization was affected by different serum concentrations. In particular, I have found that in the absence of serum SiO2-NPs mostly localized onto the plasma membrane in monocytes and HeLa, while in macrophages they were still internalized into phagolysosomes, even if with a lower efficiency. Considering this different NPs sub-cellular localization, I have investigated if the protective effect of NH4Cl, Bafilomycin AI and caspase 1 inhibitor observed in monocytes in standard culture conditions (10% FCS) was maintained also in the absence of serum. Interestingly, neither acidic compartments neutralization nor caspase 1 blockage were able to reduce SiO2-NPs toxicity in serum free conditions, suggesting that monocytes cellular death mechanism was different with or without serum. In the second part of my PhD work I have studied several aspects of nanoparticles interaction with plasma and serum proteins, since this is a very important point in nanomaterials biomedical applications. Indeed, when nanoparticles (functioning as drug-gene vectors or imaging agents) are introduced in the human body (primary, into the bloodstream), they are rapidly coated by a series of specific proteins, forming the so called “ nanoparticles corona” and mediating cellular response to nanomaterial. This problematic was approached by using Ludox TM40 as nanoparticles model (to maintain the continuity with the previous characterization work), and performing a comparative analysis between fetal calf serum and human plasma. I have found that the main proteins adsorbed to NPs surface were plasminogen, albumin, apolipoprotein AI (ApoAI), hemoglobin and apolipoprotein AII (ApoAII) from FCS, and immunoglobulins (IgG), histidine rich glycoprotein (HRG), albumin, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII and apolipoprotein CIII (ApoCIII) from human plasma. In both situations, albumin (the most abundant plasma/serum protein) was the principal polypeptide bound to NPs at very low serum/plasma concentrations, while at greater serum/plasma doses it was displaced by less plentiful proteins (over all, apolipoproteins), indicating an higher affinity of these latter for SiO2-NPs surface. Congruent with this, NPs firstly absorbed plasminogen, apolipoproteins and hemoglobin, while once these proteins were depleted from serum albumin started to bind NPs surface proportionally to NPs dose. I have also found that the serum proteins pattern associated to NPs surface was not rearranged from a neutral environment (representative of cytosol) to an acidic environment (representative of endo-lysosomes). Finally, I have investigated how single plasma opsonines could influence SiO2-NPs biological activity, finding that IgG and HRG did not protect cells against NPs toxicity, while albumin and, over all, high density lipoproteins (the complexes containing ApoAI, ApoAII and ApoCIII) strongly reduced NPs adverse effects by inhibiting NPs cellular association

Le nanoparticelle sono strutture di diverse dimensioni (1-100 nm) e varia composizione (ossidi metallici, polimeri di silice, polimeri di acidi organici), presenti nell’ambiente come conseguenza di processi naturali (eruzioni vulcaniche, erosione di rocce) o antropogenici (inquinamento, attività industriale). Negli ultimi decenni esse sono state intensamente studiate e ingegnerizzate a scopo industriale (come additivi di cibi, cosmetici e materiali utilizzati nell’edilizia) e nell’ambito biomedico, in cui possono essere impiegate come vettori per farmaci o agenti di imaging. Grazie alla sua abbondanza, economicità e resistenza, il biossido di silicio (SiO2) è, nella sua forma amorfa, uno dei materiali maggiormente usati sia in ambito industriale che biomedico (contrariamente alla forma cristallina che provoca l’insorgenza della silicosi, una malattia polmonare cronica molto diffusa nei minatori, lavoratori di ceramica e altre categorie occupazionali quotidianamente esposte a cristalli/fibre di silicio). Nonostante la silice amorfa sia considerata molto meno pericolosa di quella cristallina, studi recenti condotti in vitro e su modelli animali hanno messo in luce un potenziale citotossico e pro infiammatorio. Per chiarificare questo aspetto, nella prima parte del mio dottorato ho caratterizzato la citotossicità e l’induzione di una risposta pro infiammatoria di nanoparticelle di silice amorfa (la variante commerciale non fluorescente Ludox TM40 e la variante fluorescente Stöber) su due modelli di cellula fagocitica (monociti e macrofagi primari umani) e in due modelli di cellula non fagocitica (linfociti primari umani e la linea stabile epiteliale HeLa). In particolare, mi sono concentrata sui possibili meccanismi coinvolti nell’azione delle nanoparticelle e su come il siero possa influenzarli. Un primo risultato ha indicato una maggior tossicità delle nanoparticelle di silice (valutata in termini di disfunzione mitocondriale e permeabilizzazione della membrana) nelle cellule fagocitiche, associata anche alla produzione delle tre principali citochine pro infiammatorie (IL-1beta, TNF-alfa and IL-6). Più in dettaglio, la dose di nanoparticelle in grado di uccidere il 50% delle cellule (LD50) dopo un trattamento di 18 h è risultata essere di 40 µg/ml, mentre le cellule non fagocitiche hanno mostrato una maggior resistenza alle nanoparticelle (LD50 300-500 µg/ml). Analizzando il tipo di morte indotta dalle nanoparticelle di silice, le cellule HeLa hanno mostrato un fenotipo apoptotico, mentre i monociti, macrofagi e linfociti sono risultati andare incontro a necrosi. Da una valutazione al citofluorimetro e al microscopio confocale dell’associazione e della localizzazione cellulare delle nanoparticelle è emerso che queste venivano internalizzate in compartimenti acidi nelle due cellule fagocitiche, mentre nelle cellule HeLa rimanevano legate alla membrana plasmatica. Questo risultato ha suggerito che la maggior sensibilità dei fagociti fosse dovuta a una maggior captazione delle nanoparticelle che, una volta accumulate all’interno di endo-lisosomi, potessero provocarne la rottura con la conseguente liberazione di enzimi litici (proteasi, idrolasi, lipasi) in grado di danneggiare la cellula. A questo proposito, è stato valutato il contributo dell’ambiente acido degli endo-lisosomi alla tossicità delle nanoparticelle di silice nei fagociti trattando le cellule in presenza o in assenza di due agenti neutralizzanti (NH4Cl o Bafilomicina AI), ottenendo una diminuzione della citotossicità della silice nei monociti e solo un lieve effetto nei macrofagi. Come anticipato precedentemente, le nanoparticelle di silice si sono mostrate in grado di indurre una risposta infiammatoria (più evidente nei monociti) caratterizzata da un’iniziale fase di latenza fino al raggiungimento della soglia di tossicità, un picco centrale e una fase finale decrescente (in corrispondenza delle dosi più alte di nanoparticelle) a causa della forte e anticipata morte cellulare. In particolare, l’ IL-1beta è risultata essere la citochina prodotta più abbondantemente, seguita dal TNF-alfa e dall’IL-6; inoltre, in copresenza di nanoparticelle e LPS essa veniva secreta in modo sinergico. Dal momento che la silice cristallina è in grado di attivare l’inflammasoma NLRP3 (un complesso multi proteico citosolico responsabile della produzione di alcune citochine pro infiammatorie, prima fra tutte l’ IL-1beta una parte del lavoro di tesi è stata dedicata allo studio dell’attivazione di NLRP3 da parte di nanoparticelle di silice amorfa nei nostri due modelli di cellula fagocitica. Inizialmente è stata evidenziata sia in monociti che in macrofagi la capacità delle nanoparticelle di silice amorfa di aumentare i livelli di pro IL1-beta e stimolarne la conversione nella forma matura IL-1beta tramite un processo dipendente dall’attivazione della caspasi 1, della secrezione di ATP ed dal successivo legame di ATP al suo recettore P2X7. Inoltre, a seguito del blocco di P2X7 con uno specifico inibitore la mortalità indotta dalle nanoparticelle di silice non ha subito variazioni sia nei monociti che nei macrofagi, mentre i monociti hanno mostrato una maggior resistenza alle nanoparticelle in presenza di un inibitore della caspasi 1, segno di una possibile morte per piroptosi causata dalle nanoparticelle in queste cellule. Un altro aspetto importante presentato in questa tesi di dottorato riguarda l’influenza del siero (FCS) sugli effetti citotossici e pro infiammatori indotti dalle nanoparticelle di silice amorfa. Innanzitutto, all’aumentare della concentrazione del siero sia la soglia di tossicità sia l’LD50 delle nanoparticelle di silice sono risultate spostate verso valori più alti, indicando un effetto protettivo dell’ FCS (più evidente nei non fagociti rispetto ai fagociti), cosi come la produzione di citochine pro infiammatorie nei monociti e nei macrofagi. Per capire se questo spostamento fosse dovuto a una diversa associazione delle nanoparticelle alle cellule sono stati fatti esperimenti con le nanoparticelle fluorescenti Stöber, che hanno evidenziato come la presenza di siero fosse in grado di diminuire il legame fra la nanoparticelle e le cellule, in particolare nel caso dei linfociti e delle HeLa. Questo risultato è in accordo con la precedente osservazione di un maggior effetto protettivo del siero nei non fagociti, e rafforza l’ipotesi che la tossicità delle nanoparticelle sia in qualche modo legata al loro livello di interazione con le cellule. Inoltre, anche la localizzazione intracellulare delle nanoparticelle è risultata essere influenzata dalla concentrazione di siero. In particolare, in assenza di siero le nanoparticelle erano prevalentemente distribuite sulla membrana cellulare nei monociti e nelle HeLa, mentre nei macrofagi venivano internalizzate in fago-lisosomi, anche se meno efficientemente che con 10% FCS. Vista la diversa localizzazione subcellulare nelle due diverse condizioni di siero, ci si è chiesti se l’effetto protettivo dell’ NH4CL, Bafilomicina AI e dell’inibitore della caspasi 1 osservato nei monociti nelle condizioni di coltura standard (10% FCS) venisse mantenuto anche in assenza di siero. Né la neutralizzazione dei compartimenti acidi né l’inibizione della caspasi 1 si sono dimostrati efficaci nel prevenire la tossicità, indicando che nei monociti il meccanismo di morte cellulare fosse diverso in assenza o in presenza di siero. Nella seconda parte della mia tesi di dottorato ho analizzato diversi aspetti dell’interazione delle nanoparticelle con le proteine del plasma e del siero, essendo questo un aspetto cruciale nell’applicazione dei nanomateriali in campo biomedico. Infatti, nanoparticelle introdotte nell’organismo (in particolare del circolo sanguigno come vettori per farmaci o agenti d’immagine) vengono rapidamente rivestite da una serie di proteine (costituenti la cosiddetta “corona di proteine”) in grado di mediare l’interazione cellula-nanoparticella. Questa problematica è stata affrontata utilizzando come nanoparticelle modello le Ludox TM40 (per mantenere la continuità con la caratterizzazione fatta in precedenza) ed eseguendo esperimenti in parallelo con il siero fetale bovino ed il plasma umano. Le principali proteine del siero bovino legate alle nanoparticelle di silice sono risultate essere il plasminogeno, l’albumina, le apolipoproteine AI e AII e l’emoglobina, mentre quelle del plasma umano le immunoglobuline, l’histidine rich glycoprotein, l’albumina e le apolipoproteine AI, AII e CIII. Il pattern di proteine adsorbite alle nanoparticelle di silice ha evidenziato che a basse concentrazioni di siero/plasma la principale proteina legata era l’albumina (la proteina più abbondante del siero/plasma), mentre all’aumentare della concentrazione di siero/plasma essa veniva “spiazzata” da proteine meno abbondanti (in primis dalle apolipoproteine), suggerendo una maggiore affinità di queste ultime per la superficie di nanoparticelle di silice amorfa. In accordo con questa ipotesi, le nanoparticelle inizialmente legavano il plasminogeno, l’emoglobina e le apolipoproteine, mentre solo quando queste proteine venivano esaurite dal siero (in presenza di alte dosi di nanoparticelle) iniziava a legarsi l’albumina, proporzionalmente alla quantità di nanoparticelle presenti. Dall’analisi del pattern di proteine legate alla silice in presenza di differenti pH è emerso che esso non subiva variazioni rilevanti in presenza di un ambiente neutro (rappresentativo del citoplasma) o di un ambiente acido (rappresentativo degli endo-lisosomi). Infine, esperimenti preliminari su come le singole proteine della corona potessero influenzare l’attività biologica delle nanoparticelle hanno indicato né le immunoglobuline né l’HRG erano in grado di diminuire gli effetti citotossici delle nanoparticelle, mentre l’albumina e, in particolare, le HDL erano fortemente protettive, riducendo l’associazione delle nanoparticelle alle cellule